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【摘要】 由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸成本高昂，化学合成茶氨酸工艺较复杂，组织培养合成茶氨酸产量低，因此有必要寻找一个有效途径。γ-谷氨酰转肽酶的基因广泛存在各种生物中，它具有催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸能力，为大量合成高纯度的茶氨酸合成提供新的思路。利用PCR技术，以原核生物大肠杆菌DH5a的全基因组为模板克隆出γ-谷氨酰转肽酶目的基因片段GGT，并将其转载到pET-28a上，最终转入到原核表达型宿主菌BL21中，诱导表达出γ-谷氨酰转肽酶（GGT），为利用生物转化方法生产茶氨酸奠定基础。
【关键词】 γ-谷氨酰转肽酶；茶氨酸；蛋白表达；基因克隆
he gene cloning and expression of γ-gamma glutamyl transpeptidase in procaryoteSHI Lin-mei, ZHAN Zha-jun, WANG Dong-ming.Lishui Profession and Technology College, Zhejiang 323000,China【Abstract】 Higher pure theanine abstracted from tea is so costly, the chemic synthesis of theanine is a complicated craftwork and the lower output of theanine by plant tissue culture. So it is necessary to search an effective method. The gene of γ-gamma glutamyl transpeptidase is aboard appearing in all kinds of organism. It can catalyse L-glutamine and ethylamine to theanine, and this can offer a new consider of getting larges of more pure theanine. The GGT from E. Coli DH5a was amplified by PCR. The GGT gene was inserted in pET to yield the recombinant expression vector pET28a-ggt, over-expressed recombinant of GGT in E. Coli BL21 was achieved with pET28a-ggt at last, meantime induced γ-gamma glutamyl transpeptidase.
【Key words】 γ-gamma glutamyl transpeptidase; theanine; protein expression; gene cloning
茶氨酸（Theaine）是茶叶中含有的一种特殊的氨基酸，它是茶叶中鲜爽味物质［1～5］，其结构式如图1所示。目前除在油茶、蘑菇、茶梅、红山茶等植物中检测出微量，其他植物中尚未发现。已有很多报道其具有降血压、抗疲劳、松弛神经紧张、放松等保健功能以及增强抗肿瘤药物的疗效的医用价值，对于它的研究已逐渐成为当前茶叶研究的热点之一［6，7］。同时由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸的成本还是相当昂贵，故通过其他方法来制备已越来越受重视。组织培养和化学合成法虽已成功制备出茶氨酸，但也存在着一定的局限性。如利用化学方法合成的茶氨酸虽然步骤简单，得率也高，但产生都是DL型消旋体，L型茶氨酸只有通过拆分才能获得［8～10］。
γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是谷胱甘肽代谢途径中的一个关键酶,广泛分布在活体组织中，而谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有两种重要的抗氧化作用和整合解毒作用，对于其在人体内的存在是相当重要的。谷氨酰胺和乙胺在γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的催化作用下发生谷氨酰基反应得到茶氨酸［4］。
pET系统是有史以来在 E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统，其中的质粒能在克隆的宿主中大量复制。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译（可选择）信号控制，表达型宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导其表达［11，12］。T7 RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性，充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达蛋白；诱导表达后近几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达，降低表达水平可能对提高某些目的蛋白的可溶性部分产量有利。而该系统的另一个重要优点是在非诱导情况下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录［13～15］。可以利用该系统以上的特性，在原核生物中大量表达目的蛋白。
本实验旨在从大肠杆菌E.Coli DH5a基因组中克隆出目的基因GGT，并装载到原核表达载体PpT28a上，使其在原核生物存在及诱导其表达蛋白,为利用生物转化方法生产茶氨酸奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂 E.Coli DH5a、E.Coli BL21由本室保存，质粒小提试剂盒，DNA割胶回收试剂盒,工具酶，琼脂糖，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，2kb和15kb DNA Marker（TaKaRa）,广范围蛋白质分子量标准（Promega公司）。
1.2 目的基因GGT的获取 取100ml E.coliDH5a培养物，离心（5000rpm，10min）得到菌体沉淀。按照 0.5g菌体/4.75ml TE Buffer 的比例重悬菌体，加入10％SDS一定体积至终浓度为2%。37℃水浴30min后，加入5M的NaCl一定体积至终浓度为0.7M。然后，置于水浴锅中65℃水浴10min。水浴结束后加入6ml混合试剂（氯仿：异戊醇=24：1，V/V），轻晃试管混匀10min后离心（7000rpm，40min）。离心毕，吸上清液于另一试管，再加入等体积的异丙醇，室温放置10min。最后离心（13000rpm，15min）得到DNA沉淀。
DNA沉淀再溶于2ml TE Buffer，另加22μl Rnase A（10mg/ml），37℃水浴30min，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）。轻轻摇晃混匀几分钟后离心（7000rpm，2min），吸取上清液。再用等体积的混合试剂（氯仿：异戊醇=24：1，V/V）抽提两遍，取上清液。
上清液加入1/10 体积的3M的NaAC，并加入2倍体积的异丙醇后离心（13000rpm，30min）后小心吸去残液，再用1ml 75％的酒精（-20℃预冷）洗一遍，离心（13000rpm，30min）后用适量的TE Buffer溶解。最后取TE Buffer溶解液进行1％Agrose 电泳检测。
利用E.coliDH5a的基因组进行PCR，以获得目的基因GGT。PCR完成后，在1％Agrose 电泳检测。
1.3 pET28a-GGT表达载体的构建 经PCR扩增出来的目的基因（GGT）产物和原核载体pET28a各自进行Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，酶切后回收各自的酶切片段，在16℃水浴下进行连接过夜。已连接好的产物转化E.coli DH5a感受态细胞中，将转化后的细胞涂布在LB固体培养基平板上，同时设置阴性对照（E.coli DH5a），37℃过夜。分别挑取3～4个转化子至已带有Kan抗性的LB液体培养基中，摇至过夜。
将已摇至过夜的菌进行PCR,同时设立阳性对照。在1% Agrose 进行凝胶电泳。
最后菌落PCR获得的阳性克隆进行双酶切鉴定，酶切产物在1% Agrose进行凝胶电泳。
1.4 诱导表达 pET28a-GGT质粒转化至表达菌BL21（DE3）中，涂布在含有Kan抗性的平板上，待菌落长出后挑取单转化子培养，准备进行诱导表达。
重组菌在37℃ 220rpm下摇菌至一定浓度（OD=0.6左右）后，加入一定体积的1M IPTG,使终浓度为1mM。重组菌在37℃、220rmp下诱导为2～3h后进行SDS-PAGE电泳。
采用4%分离胶及13%浓缩胶的不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝G-250染色。
2 结果与分析
2.1 GGT的PCR扩增 根据已发表的E.coli DH5a中γ-谷氨酰转肽酶基因（GGT）序列和pET28a载体MCS位点，设计两条引物。
上游引物P1：5’-GCGCCATGGCTATAAAACCGACGTTTTTAC-3’
下游引物P2：5’-TATACTCGAGGTACCCCGCCGTTAAATC-3’
引物P1、P2的5’端分别引入了Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，以上引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。
提取的大肠杆菌E.coli DH5a总DNA为模板,利用上述合成的相应的引物P1、P2，用Taq聚合酶PCR扩增出大肠杆菌E.coli DH5a GGT自身信号肽编码基因及其结构基因。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳验证，结果表明与预计的大小一致，在1700bp左右出现一条亮带，PCR产物的琼脂糖电泳结果见图2。
2.2 pET28a-GGT构建 GGT基因和pET28a经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切获得具有粘性末端，然后在Taq酶作用下进行连接，连接后的产物如图1所示。连接后的产物转化至感受态E.coli DH5a，在LB平板（终浓度50mg/ml的Kan）上挑取单转化子。
图1 pET28a-GGT（略）
图2 PCR扩增（略）
0:DNA Marker（bp）;1:GGT
因大肠杆菌E.coli DH5a的基因组中也存在着GGT基因，故直接进行菌落PCR不可行提取但转化子的质粒，进行PCR，其PCR的结果见图3。从图中可以看出在1700bp左右出现条带，初步表明连接产物很可能是pET28a-GGT。
经菌落PCR鉴定均为阳性克隆，选取2个进行双酶切鉴定，酶切时间为2～3h，并以PCR得到的GGT基因为阳性对照，其凝胶电泳图见图4。从图中可以看出与阳性对照一样，都在1700bp左右有条带出现，可以肯定pET28a-GGT构建成功。
2.3 重组γ-谷氨酰转肽酶的诱导表达 取出1ml 经IPTG诱导的菌液，离心后加入100μl ddH2O重悬，将重悬的菌进行SDS-PAGE电泳。结果如图5。从图中可以看出，在约62KD出有蛋白出现，而且IPTG诱导后GGT蛋白的表达量比未诱导的有大幅度增加，且其他非目的蛋白表达有所减少。
图3 菌落PCR（略）
0:DNA Marker;1、2:转化子
图4 pET28a-GGT酶切鉴定（略）
0：DNA Marker（bp）;1:阳性对照;2、3：阳性克隆
图5 BL-21（pET28a-GGT）诱导表达（略）
0：标准蛋白;1: 未诱导;2: 诱导
3 讨论
γ-谷氨酰转移酶（GGT）是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一,也是催化转移L -γ谷氨酰基的特异性酶。它在生物体中分布相当广泛,从细菌到高等哺乳动物体中都有该酶的存在。在临床该酶是一些疾病检测和诊治的标志物,如各种肝脏疾病［8～10］、胃病［11］和肾病［12，13］等，且在各种生物体催化合成中有相当重要的应用。利用基因工程生产γ- 谷氨酰转移酶（GGT）的研究并不多，因其在原核生物有利于大量表达自身蛋白且性质又稳定，同时大肠杆菌由于遗传背景比较清楚，故多利用原核生物大肠杆菌来生产。在大肠杆菌中，γ- 谷氨酰转肽酶（GGT）主要存在于周质空间内，其是由两个亚基构成，一个为相对分子质量约为22kDa的小亚基，另一个为相对分子质量约为39.2kDa的大亚基。
本研究通过从大肠杆菌E.coli DH5a的基因组中获得γ-谷氨酰转移酶（GGT）基因，克隆到原核表达载体pET28a上，将重组后的pET28a-GGT转化至表达型E.coli BL21中，经IPTG的诱导后目的蛋白GGT大量表达,而非目的蛋白的表达量有所减少。相信通过不断优化条件，定能得到更高的目的蛋白表达量，为以后的进一步研究其活性及规模化应用于茶氨酸的实际生产中提供了可能。
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