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蛋白质与多肽激素的放射免疫分析

来源:网络
摘要:蛋白质与多肽激素的放射免疫分析第一节概述1960年,美国学者Yalow和Berson创立了放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA),并首先用于糖尿病人血浆中胰岛素含量的测定。放射免疫分析的物质,由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我们放射免疫分析研究起步于1962年,并迅速发展与普及,对我国生物医学的进展起着很大的促进......

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蛋白质多肽激素放射免疫分析

第一节 概述

  1960年,美国学者Yalow 和Berson 创立了放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA),并首先用于糖尿病血浆胰岛素含量的测定。这是医学生物学域中方法学的一项重大突破,开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量,从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路,使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。其后30年中,内分泌科学的飞速进展,充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1977年,这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其它领域,如病毒学、药理学血液学免疫学法医学肿瘤学等,以及与医学生物学相关的学科,如农业科学生态学环境科学等。放射免疫分析的物质,由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我们放射免疫分析研究起步于1962年,并迅速发展与普及,对我国生物医学的进展起着很大的促进作用

  一、放射免疫分析的优缺点

  (一)RIA的优点

  放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性,又具有放射性测量的高灵敏度,因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。

  1.灵敏度高一般化学分析法的检出极限为10-3~10-6g,而RIA通常为10-9(毫微克,ng)、10-12g(微微克,pg),甚至10-15g(毫微微克,fg)、10-18g(微微微克,ag)。

  2.特异性强由于抗原抗体免疫反应专一性强,所被测物一定是相应的抗原。良好的特异性抗体,能识别化学结构上非常相似的物质,甚至能识别立体异构体。

  3.应用范围广据不完全统计,目前至少已有300多种生物活性物质已建立了RIA。它几乎能应用于所有激素的分析(包括多肽类和固醇类激素),还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质(如环型核苷酸等)和药物(如地高辛毛地黄甙等)的分析,应用范围还在不断扩展。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展,有人预测几乎所有的生物活性物质,只要其含量不低于RIA的探测极限,都可建立适当的RIA法。

  4.操作简便RIA所需试剂品种不多,可制成配套试剂盒;加样程序简单一次能分析大量标本,标本用量也少;反应时间不长;测量和数据处理易于实现自动化;RIA属体外分析技术,对患者无任何辐射危害

  (二)RIA的缺点

  1.只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质,对具有生物活性百失去免疫活性的物质是测不出的。因此RIA结果与生物测定结果可能不一致。

  2.由于使用了生物试剂,其稳定性受多种因素影响,需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性。

  3.灵敏度受方法本身工作原理的限制,对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。

  4.由于放射免疫分析是竞争性的反应,被测物和标准物都不能全部参与反应,测得的值是相对量而非绝对量。

  5.存在放射线辐射和污染等问题。

  尽管RIA存在以上缺点,但它毕竟是定量分析方法的先进技术。随着科学技术的进步,放射免疫分析技术将会得到更加广泛、更加深入的发展。

  二、基本原理

  放射免疫分析技术,是把放射性同位素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法

  RIA的基本原理,是利用标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)发生竞争性结合。竞争结合反应可用下式表示:

 

  在上述反应系统中,当只有*Ag和Ab时,只产生*Ag—Ab复合物,并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入Ag,因Ag 与*Ag 免疫活性完全相同,故与Ab具有相同的亲合力。当*Ag为一定量、Ab为有限量、Ag 与* Ag 的量之和超过Ab上的有效结合位点时,*Ag –Ab复合物的生成量与Ag 的量之间呈一定的函数关系。即当Ag 量少时,Ag –Ab生成量多,而*Ag –Ab生成量增多,游离的*Ag 减少。可见*Ag –Ab复合物生成量是受Ag含量制约的。因此,在放射免疫分析中,用已知不同浓度的标准物和一定量的*Ag及限量的Ab反应,采取一定方法将B与F分开,即可算出该标准物在各浓度下*Ag –Ab复合物的结合百分率(B/T)。

  这一反应过程,可用以下简图(图8-1)说明。图中黑圈表示标记抗原,白圈表示非标记抗原,长条代表抗体,每个抗体有两个结合位点,标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。

 

图8-1 放射免疫分析原理示意图

  从图中可见,当标记抗原与抗体量一定时,结合率(B/B+F)随抗原量增加而降低。在实际工作中,以B/T的值为纵座标,标准物的浓度为横座标,绘成曲线,即竞争性抑制曲线,或称准确曲线。将未知浓度的样品按同样条件操作,所得结合率(%)与标准曲线相比,即可查出样品中待测抗原的浓度。

  放射免疫分析典型的操作程序如下:首先配制一系列已知浓度的标准溶液,并各取一定体积;于其中加入一定量的标记抗原和特异性抗体;在一定条件下使之反应平衡后,采取适当方法将B与F分离;分别测量其放射性;绘制标准曲线(图8-2)。对样品中抗原的测定,则可在同样条件下操作,在标准曲线上查得含量。

 

图8-2 标准曲线左:横座标为等份刻度; 右:横座标为对数刻度

  由此可见,要成功地进行放射免疫分析,必须解决好以下3个关键性技术问题:

  (1)标记抗原:要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性强、用量适当。

  (2)制备抗体:要求其特异性高、选用的稀释度适当。

  (3)分离B与F:理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、操作简单、适用范围广。

第二节 放射性碘标记

  在RIA中,标记抗原质量的优劣,直接影响测定结果,必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原,并保持免疫活性不受丧失。

  一、同位素的选择

  同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量,这种测量较灵敏而方便,故多用放射性同位素。标记抗原,常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其优缺点,可根据所进行的放射免疫分析的类型特点,标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择(表8-1)。大多数抗原分子中都含有C、H等原子,所以用14C或3H标记不改变抗原的结构及其免疫学活性,且14C、3H半衰期长,所标记的抗原长时间放置后仍可使用,这都是其优点。14C或3H标记的不足之处是操作较繁琐,并难以获得高比放射性的标记物;3H及14C放出的都是弱β射线,需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率的测量,且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免疫化学或生物学活性者,则仍以采用3H或14C标记物为佳。

表8-1 标记抗原常用的放射性同位素及其性质

放射性元素 半衰期 射线种类及能量(百万电子伏特
β γ

  14

C
5720年 0.155

  3

H
12.5年 0.0189
125I 60天 0.035

  131

I
8.05天 0.608,0.335,0.250 0.364,0.637,0.722

  大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构,往往容易损伤抗原的免疫化学活性;且放射性碘的半衰期较短,标记物放置后因衰变使放射性降低,因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用,放射性碘放出γ—射线,用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量,测量操作也很简单。由于这些突出的优点,目前在放射免疫分析中,使用放射性碘标记物最多。

  从应用角度来看,131I和125I又各有其优缺点,可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂规格等条件合理选用。但相对而言,125I有较多的优点,一是半衰期适中,允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间;二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线,而无β粒子,因而辐射自分解少,标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象(包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等)的标记,且操作简单,一般实验室都不难做到。

  二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记

  要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物,首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性,所以若用纯度不高的抗原作标记,则标记后必须采取适当的步骤除去杂质,以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法,否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质(这时表面上活性可能还是良好的),再经标记反应时所受的损伤,活性就会显著降低,影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原,还要采用适当方法加以标记,尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。

  多肽激素与蛋白质多用碘标记,最常用的是125I。碘化反应的基本过程如下:通过氧化剂作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法,标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团,即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原,在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的,放射性碘无法标记,必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。

  因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素,主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反应条件(pH、温度、反应时间等)及所用氧化剂的性质等也有影响。

  常用的标记方法有:

  (一)氯胺T法

  氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得,是目前使用最多的碘标记方法。

  1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一种温和的氧化剂,在水溶液中产生次氯酸,可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环羟基位的一个或两个氢,使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。

 

  2.方法以125I—AVP的制备为例。

  (1)碘化反应:AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀,室温下反应40s。

  (2)终止碘化反应:加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。

  (3)Bio—Gel P2层析纯化:将碘化反应混合液注入Bio—Gel P2柱,用0.1n HAC溶液洗脱分部收集,每2min收集一管,共收集60管。

  (4)放射性测量:测定各收集管的放射性,出现两个峰,第一峰为125I—AVP,第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管,留下备用。

  为了解标记抗原的质量,每次碘标记后应计算出碘的利用率,标记上多少放射性碘,以及每微克抗原结合上多少放射性碘。

  (5)标记抗原的贮存:经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇,分成若干小份,置于铅罐中,在-20℃以下的冰箱中贮存备用,应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的,这是因为:一是脱碘,标记的碘从原来位置上脱落,变成游离碘;二是蛋白损伤、变性,成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明显降低,标准曲线斜率变小,以致不能使用,故需分离纯化,其方法是用Sephadex G100长柱(40~80cm )过柱,洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大,是蛋白变性的聚合的大分子,尚保留部分抗原决定簇,免疫活性弱;第2个峰是纯抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题,特别对来之不易的抗原更显得重要。

  2.注意事项

  (1)放射性碘源的选用:无载体131I或125I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是131I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na2S2O5等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和试剂必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以<5mCi为宜。

  (2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例:这比例对标记结果的影响很大。如上述原因,一般标记时放射性投入量不宜过多,示踪实验室中常规每次只用1~2mCi,因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时,多肽、蛋白质用量多(即I/多肽、蛋白质比值低),能获得高碘利用率,但所得标记蛋白比放射强度低;相反多肽、蛋白质用量少(即I/多肽、蛋白质比值高),则碘利用率降低,但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动;而当此比值<1后,则碘利用率再下降的幅率较小,标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。

  (3)氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间:氧化碘化标记法中,会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂,早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大,或碘化反应时间较长,结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大,或长时间进行碘化反应,结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少,反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时,试以各种蛋白质(包括白蛋白球蛋白ACTH、胰岛素等)作微量标记,当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0~20C反应20s,碘利用率都已接近或达到最大峰,再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多,氯胺T用量也应增加,以达到预期的碘利用率,但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间(通常反应时间不要超过1min),否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活,不能用于实验。当然,减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上,否则碘源中还原剂量较多,双盲目减少氯胺T用量,就会使标记失败。一般用125I标记时,氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀,以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

  氯胺T用量减少了,Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应,实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时,加入Na2S2O5剩余量也就会随之增加,这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此,Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的,以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应(按反应克分子浓度计算,Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4),不要盲目加大用量,并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来,以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。

  某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感,还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度,以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。

  (4)碘化反应体积:系指加入Na2S2O5终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小,局部反应物浓度愈高,所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以,标记应采用比放射标记效果。当反应液量少(<0.2~0.3ml)时,反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大;当反应液量大(>0.5~1.0ml)时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时,一般多控制碘化反应体积<100μl。

  (5)碘化反应温度:温度升高,碘化反应速度加快,碘利用率有所增加。但总的来看,反应温度的影响不很大,一般从0到20℃碘利用率相差不过百分之几,故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性,则可在0℃进行碘化反应。

  (6)碘化反应的pH值:受氧化剂氧化生成的活性碘,对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用,最适pH是7.3~7.8之间。当pH变化时,碘化位置也会发生变化,例如pH值较高时,组氧酸的咪唑环也可被碘化;当pH4~5时,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚,导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应,或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时,除放射性碘源外,所有的试剂都应用适当的缓冲液配制,保证碘化反应在最佳pH条件下进行。

  (7)微量蛋白质或多肽的吸附损失:界面的吸附损失,在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的,但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I—ACTH时,所用ACTH浓度低到50Pg/ml时,因表面吸附可损失10%~30%,甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯聚乙烯容器时,能减少吸附,但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%~8%、残留在层析柱上折占5%~10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减,残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见,微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失,所以标记时投入蛋白质、多肽量过微(如<2μg)也是不适宜的,否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低,并在计算上会造成较大的误差

  (8)不同蛋白质、多肽碘化标记的差别:由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同,而且其空间结构也不相同,分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应,有的就不容易碘化,因此同样条件下进行碘化标记,不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素(GRH)、促黄体激素释放激素(LRH)等多肽,碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性;而AFP及人绒毛膜促性腺激素HCG)等的碘化标记,则较容易保存良好的免疫化学活性。

  尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别,但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素,就容易成功地获得合格的标记物。

  不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同,放射碘化标记反应后,可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质(或多肽)与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开,常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。

  (二)乳过氧化物酶法(LPO)

  本法反应温和,对抗原、抗体免疫活性影响小,已被广泛应用。缺点是标记率较低,一般为20~40%。

  1.原理此法是利用乳过氧化物酶(Lactoperoxidase)有促进微量过氧化氢125I-的氧化作用,生成125I+,并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

  2.方法以标记蛋白质抗原为例。

  (1)反应液组成:蛋白质2~5μg溶于磷酸缓冲液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);

  (2)在室温保温7min;

  (3)加入H2O2200ng(10μl);

  (4)过7min再加入H2O2(3μl);

  (5)保温7min后,加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应;

  (6)10min后加入NaI载体溶液1ml ;

  (7)按常规方法分离纯化。

  3.注意事项

  (1)LPO质量好坏,可直接影响标记率,LPO应在使用前新鲜配制,以防酶活性降低。

  (2)LPO用量应小于总蛋白质用量的1%,以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

  (3)碘化反应速率分析表明,酶的催化速度很快。

  (4)碘化反应在pH4.0~8.5较宽范围内均可进行,最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。

  (5)H2O2应保持低浓度,如高于0.1mmol/L,对酶的活性将有抑制作用。

  (三)Iodogen碘化法

  此法具有标记率高、反应体积小(3ml水平)、可用低浓度的125I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点,系常规的碘化方法之一。

  1.原理 用Iodogen为氧化剂,对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记,把125I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合,标记后取出样品即停止反应,不使用任何还原剂。

  2.方法

  (1)标记之前,先把Iodogen溶于有机溶剂,涂于管底,并使之干燥

  (2)标记时,将蛋白质溶液10~20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中,反应管置于冰浴中。碘化时,125I与蛋白质克分子之比例为1~1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min,从反应管中转移出反应混合液,使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中,层析分离前再放置5min,使其未标记的碘离子还原成分子碘,以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。

  3.注意事项

  (1)涂有Iodogen的反应管,有氮气中密封,并贮存在-20条件下,至少可用3个月。打开管,使用时间很短。

  (2)碘化反应时间,7min时标记率达最高,10min时略有减少。PH6.0~8.5时,标记率最高。

  (3)Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。

  (四)酰化试剂(Bolton和Hunter试剂)法

  1.原理这个方法用酰化剂3--(4-羟苯基)丙酸—N琥珀酰胺酯(Bolton—Hunter试剂)做连接试剂,将125I标记在羟苯基的2,5位置上,再将琥珀酰胺酯水解,通过一个酰氨键将3--(4—羟基—5—125I—苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。

  2.方法125I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备,出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯(μmol 蛋白用3~5μmol标记酯),用氮气吹除苯,投入欲标记蛋白5~10μg及缓冲液10~50μl,pH8.0~8.5为宜,在冰浴中反应15~30min后,加入多量氨基酸(如甘氨酸),使过量标记酯消耗掉以终止反应。

  此法避免了蛋白质与氧化剂的接触,又避免了与放射性碘原子的直接接触,可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤,适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心,引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂,需要接触较多的放射性,经二步反应,碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽,而适于分子量大于1万的蛋白质。

  三、放射性标记化合物的纯化与鉴定

  (一)纯化标记化合物的常用方法

  不论使用何种制备方法,要获得合格的标记化合物,都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外,一些标记化合物,经过一定时间的存放后,往往会出现不纯物,而需再纯化。如碘标记生长激素125--HGH),在刚标记的第2天,从Sephadex G-100过滤谱上可见,几乎所有的碘化HGH都集中在峰II;保存1个月后,峰II组份减少,峰I和峰III成分明显增加,峰I是集聚的标记生长激素,而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质(图8--3)。

 

图8-3 125I—HGH的Sephadex G-100过滤谱

实线:新鲜制备的 125I—HGH 虚线:保存1个月的125I—HGH

  标记化合物的纯化方法,除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外,一般需用微量分离技术,较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例,说明以上各种方法的适用情况。

  1.凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列,也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时,通常用Sephadex G—25或G—50,然后用G—100进一步纯化。

  2.离子交换法一般是制成离子交换层析柱,用于分离纯化短肽标记物。

  3.透析法 能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。

  4.电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。

  5.亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强,保持生物活性好,但操作较复杂。

  6.高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速,但需特殊设备。

  7.伴刀豆球蛋白A(ConA)吸附法ConA是一种植物凝集素,对糖蛋白有良好吸附能力,因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。

  (二)标记化合物的主要质量指标

  作为示踪剂及分析试剂的标记化合物,应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括:放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。

  1.放射性核纯度及其检查方法

  (1)放射性核纯芳可用下式表示:

  放射性核纯度(%)=所需放射性核素的活度/样品的总放射性活度×100

  (2)放射性核纯度的检查方法:每一种核素都有它的特征,即物理半衰期及射线能量,故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。

  ①测定半衰期法:如短半衰期放射性核素,一般可采用时间跟踪法,每隔一定时间测量放射性一次,共测3~5个半衰期,以每次测得的放射性计数为纵座标,时间为横座标,在半对数纸上作图,并通过分析,可求出该放射性核素的纯度。

  ②测定射线能量法:利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ发射体可用γ能谱仪,如检测57Co58Co的核纯度:纯β-发射体可用液闪仪,调节 道宽及淬火校正后,对如3H、14C、32P的核纯度进行测量;而β、γ混杂垓素,则用吸收法测量,如99mrTc中母体杂质99mMo的含量测量,是通过适当厚度的铅屏蔽,将99mTc 发射的能量为141ke V的γ射线减弱后,测定99Mo发射的能量为739Kev 的γ射线。

  2.放射化学纯度及放化纯度鉴定

  (1)放射化学纯度:放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的,所以:

  放射化学纯度(%)特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度×100

  放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产物存放条件等影响,一般放化纯度控制在95%以上。

  (2)放射化学纯度的测定方法:原则是高效的化学分离与灵敏的放射性测量相结合。常用下列方法:

  ①放射层析法,又称放射色谱法:本法是利用色谱技术使混合物中各组份分离,然后测定各组份的放射性活度。它具有选择性高、分离效果好、操作简便等优点,在放化纯度鉴定中是一种重要的分析方法。最常用的是放射性纸层析法和放射性薄层层析法。

  ②放射性高效液相层析法:它对分离纯化标记化合物及鉴定标记化合物的放化纯度都有很大潜力,具有分析速度快、分离效率高、适用范围广等特点(几乎80%的有机化合物均可应用)。关键是要选择合适的固定相和流动相,使产品与杂质分离。在流动相中,被分析物各组份的浓度变化可用紫外或荧光检测器检测,而其放射性活度,可同时由放射性探测仪测定。放射性活度测定最简单的一种办法,是将洗脱液分部收集,然后在γ仪或液闪仪上进行测量;另一种较理想的是连续测量,在洗脱液流通池外包围一个固体闪烁探头,进行γ计数或在流通池前加一个三通混合室,用另一个泵混入闪烁液,测定软β射线。可以与紫外控测器的扫描图,同步描绘出放射性的分布图。

  ③放射性核素反稀释法:取一定量(W1)已测定比活度(SO)的标记化合物(约0.1~10mg),用>1000倍化学量(W2)的纯载体稀释,充分混匀后反复纯化到比活度恒定不变(Sp),此标记化合物的放化纯度值应为:

 

  有时该值>100%时,往往是由于所用载体化学纯度不够。因本法操作要求严格,一般不作常规放化纯度鉴定用。

  3.化学纯度及化学量的测定标记化合物中的非放射性化学杂质虽一般不会对示踪结果带来直接干扰,然而这种杂质的含量越多对标记化合物在使用、存放过程中分解、变性的影响就越大。此外,也已发现某些标记化合物的化学杂质会给使用带来直接影响。如用氚标记类固醇作放射免疫分析试剂,其中的化学杂质会影响标记抗原与抗体的结合率,使分析灵敏度降低。因此,对标记化合物的化学杂质含量,同样必须加以控制。

  要制得化学纯度的标记化合物,最好是对可能产生的杂质加以防止。这要在冷试验中解决。因为冷试验所得产品是非放射性的,其化学纯度可用常规方法,如溶点、沸点测定,NMR、红外、紫外谱分析等手段加以鉴定,得到合格产品后,再按同样方法及条件进行标记制备。

  对于标记化合物的化学含量,则必需在标记反应及一定纯化步骤后进行,由于需要高比活度的标记化合物,往往样品的放射性很强,而化学量极微(如某氘标记化合物,分子量为300,每分子上标记2个氘原子,氘的同位素活度为99.8%,则理论上每25mCi(925MBq)的化学量还不足(130μg),所以需用微量分析法才能测定其含量。一般而言,各种常规微量分析技术均可应用。目前大多用紫外分光、荧光光度等进行含量测定。

  4.放射性比活度及其测定

  (1)放射性比活度简称比活度,过去也称比放射性。

  比活度=放射性活度/单位化学量

  (2)比活度的理论值计算:每种放射性核素有一个比活度理论值,取决于该核素的半衰期和衰变常数。若N是1毫克原子(1mA)的总原子数,衰变常数λ(单位时间衰变的%),则

 

  任何元素每1mA的原子数都相同,等于阿伏加德罗常数,即6.023×1020个,故

 

  若T1/2min为单位,则上式的活度单位为dpm/mA,进行单位换算后为:

 

  根据上式,可计算出每种放射性核素比活度的理论值(常用放射性核素的比活度理论值见表8-2)。如果标记化合物每分子接上一个放射性核素原子,则以上原论值亦为该标记化合物的比活度(每毫摩尔的活度)理论值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理论值

  (亦即每分子一接一个该放射性核素原子的标记化合物的经活度理论值)

放射性核素 半衰期 比活度理论值(每mA或mmol的活度)

  14

C
5730年 0.0624 Ci (2.3 GBq)

  3

H
12.33年 29.0 Ci(1073 GBq)

  45

Ca
165天 793 Ci (29.3 TBq)

  75

Se
118.5天 1100 Ci(40.7 TBq)

  35

S
87.4天 1494 Ci (55.2 TBq)

  125

I
60.2天 2196 Ci(80.3 TBq)

  131

I
8.04天 16240 Ci (600 TBq)

  (3)放射性比活度测定方法

  ①直接测定计算法:将标记产品经分离纯化后,配成合适的溶液,测定每毫升的放射性活度(如mCi/ml)及含量(μg/ml)从而计算其比活度。对于高经活度的标记物,化学含量甚低,一般需用光谱法,如紫外分光光度法测定其含量。

  ②层析扫描面积计算法:一般应用纸层析或薄层层析,将反应结果尚未分离的反应液点样、展层,然后在扫描仪上描绘放射性分布图,根据描绘的面积来进行计算,如图8-4。

 

图8-4 放射层析扫描面积计算比活度示意图

1为标记物峰面积:

S2S3为杂质峰及放射性原料峰面积

  先计算标记率:

  放射性比活度的计算:若投入的待标记物重量为W,且100%转化为标记物,则比活度=A·Y/W,其中A为投入的总放射性。

  如果层析扫描仪有紫外监测器和放射性活度计数率仪可同步测定扫描,则直接可给出比活度。

  ③自身取代计算法:这是间接测定标记物比活度的方法。所测定的标记物,需是分离纯化后可用于RIA或RRA标记试剂。

  方法的原理是:作一条常规的RIA(或RRA)标准曲线,另作一条不加非标记标准品,只加抗体和不同量标记试剂的自身取代曲线。两者用同一种抗体,且抗体用量完全相同。若反应平衡后测定结合部分的放射性,掏算成所加总放射性(注意:对标准曲线总说总放射性各管相同,对自身取代曲线来说各管不同,需分别换算)的百分数,即结合率B。由于两条曲线所用抗体的质和量严格相同,标记物与非标记标准品与抗体亲和力也相同,故B的大小就完全取决于各管中标记物和非标记标准品的总量。亦即若从两标准曲线上取一点相同的B,则

  (标记物+标准品)标准曲线=(标记物)自身取代曲线

  故由此便可直接计算标记试剂的化学含量并进一步求得比活度。为求准确度高,可取我点B求出平均比活度。

  用自身取代法测定标记化合物的比活度,只适用于RIA的标记抗原及受体的标记配基。使用时应注意:①标记物与未标记物对抗体(受体)的亲和力应相同;②非特异性结合应较小,且计算时应扣除;③制备标准曲线与自身取代曲线时,操作步骤应相同,特别是B与F分离的条件要一致。

  5.生物活性、免疫活性测定

  (10)生物活性、免疫活性测定的重要性:放射性标记化合物作为示踪剂用于生物体内的示踪研究,或作为分析试剂用于生物活性物质分析,都要求标记化合物不改变其原有的生物活性和免疫活性。当给化物引入放射性原子,即使“同位素标记”大多需经过原子交换或化学反应及分离纯化等物理化学处理,有可能造成光学构型及立体构型的改变而使标记物改变性质。“非同位素标记”,如蛋白质分子中引入碘原子,则更易引起蛋白质失活、变性。故测定放射性标记化合物的生物活性和免疫活性,对保证使用效果十分必要。

  (2)生物活性和免疫活性测定的要求:需根据使用要求而定,因为同一标记物其生物活性的变化与免疫活性的变化不一定相关;同一标记激素,其与受体结合能力的改变与抗体结合能力的改变也不一定平行。

  (3)测定方法:测定标记蛋白质或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述几种:

  ①物理化学方法:可用电泳法、吸附法及凝胶过滤法等物理化学方法来测定标记蛋白质的结构改变情况,如标记后受损全伤的蛋白质在电泳时泳动性减少,碘化受损的多肽激素在血红蛋白涂碳上的吸附性质也有改变,而蛋白质变性聚合时大分子聚合体将在凝胶过滤时不停留在凝胶柱上。这些测定虽较快速方便,但对标记物的生物活性和免疫活性的严格判定来说,还是很不够的。

  ②特异结合试验:根据放射性标记化合物用于放射免疫分析等不同要求,分别与其相应抗体或受体进行特异性结合试验。以放射免疫分析试剂为例,测定其免疫活性的方法是:先观察标记物与抗体的结合率,如果结合率高,说明抗原的免疫活性较好。进一步观察标记抗原与非标记对抗体亲合力是否一致,做法之一是用不同稀释度的抗体,分别与标记抗原及与标记抗原加非标记抗原的混合物进行特异结合,其中混合物抗原总浓度要和单独使用放射性抗原的浓度相同。如单独使用标记抗原1.0ng,而混合抗原的总浓度亦为1.0ng,其中标记抗原为0.1ng,非标记抗原为0.9ng,比较两者的结合率,如果基本相同,说明标记抗原保持其原来的亲和力,在标记等操作过程中未受到明显损伤。如图8-5中,A线与B线基本平行;如果标记抗原免疫活性已有降低,则如C线所示。

 

图8-5 标记蛋白的免疫活性测定

  A;为标记抗原与血清的滴度曲线B:为非标记抗原(加入少量标记抗原)的滴度曲线;C:与A相同,但标记抗原免疫活性已有降低

  ③生物特性测定:如125I—纤维蛋白原,可用凝血酶测定其可凝能力,与非标记物相比,视是否有改变。使用何种生物特性测定,根据标记物的生物性质而定。另外,上述特异性结合试验,如果受体作异结合剂,也是检验用作RRA或RBA分析试剂的标记物生物活性情况的有效方法。

第三节 结合和游离部分的分离

  放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微,反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物,但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的(B)和游离的(F)抗原,所以,B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节 。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同,可采取各种分离技术。

  一、对分离方法的要求

  分离方法的选择直接影响分析的质量,通常需满足以下要求:

  ①使B和F分离完全;②不受外界因素的干扰而影响分离效果;③与游离抗原的非特异性作用尽可能小;④操作简便,分离迅速,重复性好,适用于大量样品分析;⑤来源广,价格低廉,便于使用,适合RIA技术自动化。

  二、常用的分离方法

  目前用于放射免疫测定中的分离方法很多,各有其优缺点,下面介绍几种常见的分离方法:

  (1)吸附分离(固相颗粒)

  活性碳吸附剂(目前常用)

  硅镁吸附剂(滑石粉等)

  交换树脂吸附剂

  (2)蛋白沉淀剂

  硫酸铵、硫酸钠

  聚乙二醇PEG)(目前常用)

  无水乙醇、丙醇等

  (3)免疫分离剂(第二抗体)

  (4)磁性分离剂

  磁化活性碳吸附剂

  磁化固相抗体

  (5)固相包被分离法(固相分离剂包被在测试管内)

  (一)吸附分离法

  这种吸附分离剂是固相颗粒,它可以从反应液中吸附游离抗原。

  活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞,在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时,小分子的游离抗原被活性炭吸附,达到分离B与F的目的。

  活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉,缺点是离心沉淀部分是F而不是B,不适用目前自动化放免测定,分离时易受温度和时间的影响。

  (二)沉淀分离法

  沉淀分离法的原理,是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀(这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中)。常用的沉淀剂是聚乙二醇(PEG)。PEG是一种直链大分子聚合物,使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在,而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响,PEG离心温度在20以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉,操作简便,一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高,所以常与其它方法联合使用;其分离效果易受pH、温度等影响。

  (三)双抗体分离法

  双抗体分离法也称免疫分离法,是特异性分离,应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合,形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠,称为第一抗体,形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体,该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物,经离心可将其沉淀,从而达到分离的目的(图8-6)。

 

图8-6 双抗体法分离原理模式图

  第二抗体分离的优点是重复性好,B和F分离较为完全,非特异结合低,可同时处理大量样品,使用方便。缺点是分离时间长,非特异性结合可有较大的波动,第二抗体用量较大。

  (四)磁性分离法

  1975年,Hersh报道了用磁化分离技术分离血清狄高辛放免测定的B、F后,受到了广泛的重视。近年来国内外许多学者对磁化颗粒的制备进行了系统地研究,应用于B与F的分离,并取得了引人注目的进展,使放免的B、F分离不再使用离心,缩短了放免操作时间,便于放免自动化测量。磁性分离的具体原理为血清样品与标准品中的抗原与磁颗粒上的一定量的抗体反应,产生的抗原抗体磁性颗粒复合物,在磁场作用下沉降,使结合部分与游离部分分离。在磁性分离器上弃上清,进行测量。优点是简化了操作程序,B、F分离也较完全,稳定性好。

  目前常用的磁性分离技术除磁性固相抗体外,还有磁化活性炭吸附分离剂。

  (五)固相包被分离法

  近年来由于固相技术的研究使其固相所被(埋)技术发展迅速,再有固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等优点,有逐渐取代液相法的趋势。

  1990年,Causse报告了活化塑料管新技术及生物素结合抗体、亲和素标记物的应用,使放免技术对多数微量物质的检测可达到10-15g级水平,大大提高了放免测定的精确度、灵敏度。

  抗体包被:物理吸附法—方法简便,但包被量低。

  价键结合法—需要纤维素琼脂等固相载体,操作复杂。

  Causse活化塑料管新技术,提高了包被量,主要特点是将顺丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚体涂布试管,在试管壁形成一层活性薄膜(这种方法操作简便)。

  (六)双抗体+PEG的分离法

  这种分离方法利用双抗体特异性强、PEG沉淀简便快速的优点,从而克服了双抗体时间长、PEG方法非特异结合高的缺点。这一方面是当前分离技术中较理想的一种方法。

  这种联合方法分离方法减少了第二抗体的用量,PEG的最终浓度也只需2~4%,成本较低。这种方法既适用于蛋白质、酶、大分子物质,又适用于小分子肽等半抗原物质。

  1991年,北京中国同位素公司北方免疫试剂所采用80年代法国广泛应用的双抗体+PEG、再加一定剂量的γ球蛋白(免疫第二抗体时应用的γ球蛋白)的分离剂,溶解于磷酸缓冲液中,pH在7.4左右。这种分离剂推广应用产生了很好的效果。沉淀完全,牢固,而非特异性结合低,时间短(加入分离剂15min后即可离心),受温度影响小,受到用户的广泛好评。

  以上方法,要依据反应液中反应物分子量大小,酸碱度等特点,选择合适的分离方法及分离剂。

第四节 样品的前处理

  样品的正确收集与处理,是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目,其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例,介绍样品的前处理方法。

  一、脑、脊髓垂体中神经肽的提取(以大鼠为例)

  1.大鼠称重后,在尽量安静的情况下,迅速断头、取躯干血

  2.尽快取下全脑、脊髓(某段)与垂体,在沸生理盐水中煮5min,以灭活酶,保持神经肽的稳定。

  3.根据实验要求分出脑区(如小脑、桥延脑、下丘脑、中脑或中灰质丘脑、皮层、海马、纹状体等与垂体前叶。

  4.脑区等称重。

  5.把脑区、垂体或脊髓,分别置于玻璃匀浆管内,加入1mol/l HAC(或HCl)1ml,充分匀浆后倒入塑料指形管中,在室温下放置100min,使生物活性物质充分溶解在酸中。

  6.加入1mol/l NaOH 1 ml,中和酸。

  7.离心,取上清。

  8.低温(-20以下)保存待测。

  二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法(以下丘脑为例)

  1.大鼠迅速断头,取出全脑,置沸生理盐水中煮5min。

  2.将全脑置于取材角度器上,分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断,取下丘脑块。

  3.将双面刀片装在切片机上。

  4.将下丘脑置于切片机机载物台上,腹侧向下,并用502胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

  5.开动振动切片机,缓慢移动推进器,切片厚400~500μm。用毛笔沾生理盐水,小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

  6.将脑切片平置于橡皮板上,并在体视显微镜下,参照鼠脑立体定位图谱,确定神经核团位置。

  7.选择相应直径的穿孔器,分别于两侧核团上垂直插下,然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

  8.加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中,放置100min。

  9.加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸,离心(3000rpm/min)20min,取上清液,低温保存待测。

  三、内脏肿瘤组织中神经肽的提取(以胃粘膜为例)

  (1)取下胃粘膜后,迅速称重置于试管,中沸蒸馏水1ml,在水浴中煮100min。标本在室温下放置,其中的生物活性物质会被酶降解,所以要立即加热处理。

  (2)冷却后倒入特殊的匀浆器中,充分匀浆(使用电动搅拌器)。匀浆液倒入塑料指形管中,再用蒸馏水1ml,冲洗匀浆器,并倒入上述管中。

  (3)离心,取上清,低温保存待测。

  四、血浆

  1.直接测定

  (1)加酶抑制剂:准确采全血若干毫升,注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠)溶液(每毫升全血20μl)、或1%肝素(每毫升全血10μl);②抑肽酶(每毫升全血500单位)的塑料指形管中,迅速低温离心,取血浆低温保存待测。

  抑肽酶有液体的(标签写的有每毫升含多少单位)与固体的(每毫升含12TIU,1TIU=900KIU,即每毫克含10800单位)。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解,使之每20μl含500单位。

  (2)酸化处理:每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml,低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

  以上两种方法,任选一种即可。

  2.间接测定血标本经提取后,可去除蛋白质等干扰因素,并使微量的生物活性肽浓缩,但较费时,成本也高。常用的提取方法有:

  (1)柱层析提取法:有多种层析柱可供提取不同的神经肽,其中较为方便的是用Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤步:

  ①柱的预处理:该柱有两头,长头连接注射器,可注入溶液与样品,短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml,使柱中的生物胶活化。

  ②注入样品(如血浆、脑脊液腹水、尿等):样品中的水份流出,生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前,如先去除蛋白,可增加柱子的使用时间。]

  ③淋洗:用4%HAC溶液100ml注入柱中,以洗去一些杂质。

  ④洗脱:用7ml酸性乙腈(按容积算,每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml)作为洗脱剂,注入柱中,把生物活性肽洗脱下来,收集在塑料指形管中。

  ⑤清洗:用乙腈、蒸馏水清洗柱子,以备后用。

  ⑥将洗脱液吹干,低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

  Sep-Pak C18柱层析,也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

  (2)加膜藻土提取法:

  ①抽血:用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml,置于加有肝素(125单位/ml 全血)指形管中。

  ②分离血浆:在4下离心,取出血浆。

  ③血浆酸化:取2ml血浆,加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

  ④吸附:加入0.5%藻土悬液2ml,在水平震荡器上震30min。离心,去上清,留沉淀。

  0.5%藻土县液(Fuller’s earth)的配制:

  0.5g Fuller’s earth

  0.1g Dextran T70

  100ml去离子水

  ⑤洗脱:在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml,在漩涡振荡器上振2min,离心,取上清置于经硅化的玻管中。

  80%酸性丙酮的配制:

  80ml丙酮

  20ml 1mol/L HCl

  ⑥去脂:加入石油醚1ml,摇匀,脂肪溶解在石油醚中,分层后吸去上层。

  ⑦干燥:下层液体,置于37℃水浴中,用氮气(或空气)吹干。

  ⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

  (3)有机溶剂提取法:常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例,加入标本内,混匀、振荡、离心,取上清吹干,冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

  在这些方法中,以柱层析法最稳定、准确,但成本高,推广不易。加膜藻土法,提取率较高,但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便,成本也低,虽稳定性较差。

  五、脑脊液

  1.煮沸收集脑脊液时,管子浸在冰水中。收集完毕,立即在沸的水浴中煮5min。离心、取上清;低温保存,待测。

  2.酸化在1ml脑脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml;测定时,再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

  3.加酶抑制剂

  4.柱层析提取

  以上方法,任选一种。

  六、尿

  尿液收集于事先加有适量醋酸盐酸的容器中,使pH达4左右,煮沸1~2min,冷却后离心,取上清,加适量NaOH液,使尿液pH达7.0左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

  尿认提取法相同。采用Sep—Pak C18柱层析提取较为方便,因尿中不含蛋白,柱子可多次使用。

  七、胃液

  抽取胃液,注入加有抑肽酶的管中,离心,取上清,低温保存待测。

第五节 放射免疫分析法的建立

  一、放射免疫分析的基本试剂

  (一)标准品

  标准品是放射免疫分析法定量的依据,由于以标准品的量用来表示被涮物质的量,故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外,还应具备稳定性,即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

  按实验要求,将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液,用于制作标准曲线。

  (二)标记物

  标记抗原应具备:①比放射性高,以保证方法的灵敏度;②免疫活性好;③所用的核素的半衰期尽可能长,标记一次可较长时间使用,这对来之不易的抗原尤其重要;④标记简便、易防护。

  要准确测量B与F的放射性,必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量,在使用125I时达5000~15000cpm。

  (三)抗体

  应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体,用于放射免疫测定。

  根据稀释曲线,选择适当的稀释度,一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

  (四)B与F分离剂

  以2%加膜活性炭溶液为例,2%加膜活性炭溶液的配制:

  活性炭2g(杭州木材厂生产,森工牌732型)

  右旋糖酐T200.2g

  加0.1mol/L PB 至100ml

  电磁搅拌1h,然后置于变通冰箱冰箱待用。

  (五)缓冲液

  放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种,要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

  目前最常用的缓冲液有下列几种:①磷酸盐缓冲液;②醋酸盐缓冲液;③巴比妥缓冲液;④Tris –HCl缓冲液;⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

  在缓冲液中,除必须有弱酸及弱酸的盐成分外,还应根据不同检测项目加入下列物质:①保护蛋白:常用的有牛血清白蛋白或白明胶,浓度为0.1%~0.2%,用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂:多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶抗菌素。③酶抑制剂:如测定心钠素等肽类激素时,要加入适量的抑肽酶,用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解;又如测定cAMP、cGMP时,需加入EDTA·2Na,抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂:在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时,必须加阻断剂,使和蛋白质相结合的激素,变为游离型。常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白:采用二抗作B与F分离剂时,要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时,用PEG沉淀剂分离B、F,必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

  在神经肽的RIA时,常用PELH缓冲液,(按1000ml,pH7.6):

  0.1mol/l PB        980.0ml

  0.3mol/L EDTA·2Na     10.0ml

  0.2%洗必泰溶液       10.0ml

  溶菌酶           1.0g

  二、加样程序

  由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同,而出现两种加样程序,分述如下:

  (一)平衡饱和加样程序

  1.基本原理所谓平衡饱和,是指抗原和抗体反应达到再不结合,也不解离的平衡状态,称为饱和状态,即平衡饱和。所以,有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

  2.加样程序一般先加标准物或被测样品,再加抗血清,最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合,提高抗原的竞争抑制能力。

  在小分子半抗原的放射免疫分析中,标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的,前者比后者的亲合力高。因此,上述加样程序就更有必要,所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清,后加标记物。这样测定也比较稳定。

  在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中,如果是双抗体分离法,抗原和标记抗原与抗体三者加样,可不分先后,有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序,但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24~48h,再加双抗体,继续温育24h,使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析,应用双抗体分离法,其流程比较长,这样的顺序同样可不分先后。

  以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例:

  (1)加样(单位μl;总反应体积500μl)

  标准曲线 样品
  T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂体 下丘脑
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
β-EP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / /
样品 / / / / / / / / / 1 100
β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100

  125

-β-EP溶液
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
缓冲液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

  (2)孵育:4℃,24h

  (3)分离B与F:每管加入2%加膜活性炭溶液300μl,摇匀,立即离心,去上清,测沉淀(F)的CPM数。

  (二)顺序饱和加样程序

  1.基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀,免疫反应6~24h,使抗原与抗体充分结合,甚至达到平衡,然后再加入标记抗原,与抗体反应12~24h,最后分离B与F,这称为顺序饱和分析法。

  应用顺序饱和加样,可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素TSH)放射免疫分析时,将标记物延至第2天加入,发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间,仍可取得满意的结果。所以一般认为,在顺序饱和加样中,第1次温育时间可以长,而第2次温育时间要短,这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见,认为顺序饱和加样,是使用过量抗体,会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量,温育时间缩短,在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物,这样既不影响加灵敏度,反而比较稳定,甚至可提高灵敏度。

  2.加样程序 以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例(直接测定)。

  (1)加样(单位μl;总反应体积600μl)

  标准曲线 血浆
T NSB Bo 1Pg 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AVP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 /
样品 / / / / / / / / / 300
无肽血浆 / 300 300 300 300 300 300 300 300 /
AVP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100
缓冲液 / 200 100 / / / / / / 100
在4C下孵育12~24h

  125

I-AVP
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

  (2)孵育:4,24h。

  (3)分离B与F。

  无肽血浆,用于血浆的直接测定。其制备方法为:在电磁搅拌下,抽取2%加膜活性炭溶液5ml,共两管,离心、去上清。血浆5ml,倒入上述活性炭管中,加盖,充分振荡10min,离心,上清倒入上述另一活性炭管中,振荡10min,再离心,取上清,即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

  (三)计数、绘制标准曲线与测定样品含量

  以活性炭分离B与F,沉淀计数是F的cpm。T—F—NSB,得B的cpm数。

  计算标准管与样品管结合(B)的cpm数及与零标准管结合(B0)的比(B/B0×100%)。

  用半对数纸,以标准管的B/B0为纵座标,以各标准管含量为横座标,绘制标准曲线。

  根据样品的结合率(B/B0×100%),从标准曲线中找出被测样品抗原的含量,再换算成每毫升血浆含某抗原的量,或每毫克(组织湿重)含某抗原的量。

  三、放射免疫分析的质量控制

  (一)质量控制的目的和内容

  放射免疫分析的质量控制实际上就是控制测定误差,监督测定结果。它包括两方面的内容:一方面对测定结果做精确分析;另一方面鉴定常规测定方法,对那些测定结果不好的方法加以改进,并建立新的测定方法。质量控制分四个方面:

  1.在一个测定方法内产生的误差。

  2.在同一实验室内不同方法之间产生的误差。

  这两种情况属于内部质量控制。

  3.用同一测定方法,在各实验室之间产生的误差。

  4.采用不同方法,在各实验室之间产生的误差。

  后两种情况属于外部质量控制。

  (二)放射免疫分析中造成测量误差的因素

  误差包括系统误差随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因,使测定结果呈倾向性偏大或偏小,这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的,没有固定的倾向性,这类误差是不可避免的,必要时做统计学处理。

  造成误差的可能来源有以下几个方面:

  1.各种仪器:设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如:①由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。②由于样品的自吸收,本底校正,测定时间,可能的污染等原因。③在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。④由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。

  2.试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度,辐射自分解,抗体的稳定性,分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。

  3.在放射免疫分析中一些基本操作,如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差,如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。

  4.样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件,微量样品取样的准确度,样品可能造成的污染以及样品的变性(如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等)也都能造成测量的误差。

  5.提取及层析分离过程中的丢失。

  (三)放射免疫分析中测量误差的控制

  1.选择准确性高的方法:对各种方法进行比较,淘汰粗糙及难以重复的方法。

  2.建立方法对比。用相同的测量方法和不同的测量方法在同一实验室和不同实验室,在同一地区和不同地区,在同一时间和不同时间,对同一样品进行对比,检查产生误差的原因。

  3.建立各种类型的标准。对标准品应规定纯度及制备方法,使用年限及贮存条件。

  4.建立操作规程,按章 操作。对使用的试剂、仪器设备要经常检查其有效性,更换试剂时应进行必要的鉴定,必要时对测定方法要做重复性试验和回收试验

  5.建立可靠的检查制度。经常对测定结果进行核查,利用控制血清、标准血清检查每批结果的准确性。

  参考文献

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  9.祝元祥,等.β-内啡肽的抗血清制备及其放射免疫测定.第二军医大学学报,1986;7:332~336

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  11.王成海,等.强啡肽A1-13的放射免疫测定.中国药理学报,1987;8:494~497

  12.Abrahom, GE. Handbook of Radioimmunoassay. New York:and Basel, 1977

  13. Yalow , RS. Methods is Radioimmunoassay of Peptide hormones. Amsterdam:North –Holland Pub. Co, 1976

  14. Pasternak, CA. Radioimmunoassay in Chinical biochemistry.London Heyden, 1975

作者: 佚名 2008-2-3
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