高效液相色谱法分离/蒸发光散射和紫外检测法测定天麻中天麻甙含量

高效液相色谱法分离/蒸发光散射和紫外检测法
测定天麻中天麻甙含量
魏 泱     丁明玉*     李红霞
（清华大学化学系，北京，100084）

关键词 高效液相色谱法；蒸发光散射检测法；紫外检测法；天麻；天麻甙
中图分类号 O658

天麻(Gastrodia elata Blume)系兰科多年生寄生植物，用于治疗头昏，眩晕，肢体麻木等症。冯孝章等 [1]和周俊等 [2]分离并鉴定出天麻的活性成分有天麻甙(对羟甲基苯 b-D-吡喃葡萄糖甙，亦称天麻素)、 天麻甙元(对羟基苯甲醇)等.其中天麻甙为主要成分。之后的一些药理实验[3]也证实了这一点. 在测定天麻甙含量的方法中, 高效液相色谱法(HPLC)采用得最多. 正相HPLC[4]和反相HPLC[5]都可用于天麻及其制剂中天麻甙的分离，通常采用紫外检测法，检测波长在220 nm或270 nm处. 
蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种半通用型质量检测器，可用于检测类酯[6]、糖[7]等物质. 近年来，它在对天然药物的检测方面应用也越来越多，如对人参皂甙[8]、银杏内酯[9]的检测。HPLC/ELSD测定天麻甙尚未见报道. 
1.实验与方法
1.1仪器与试剂  HP1100高效液相色谱仪(美国Hewlett Packard公司产品)配有四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)和化学工作站. 另配有Alltech 500 ELSD(美国Alltech公司产品). 
天麻甙为分析纯，购自中国药品生物制品检定所；对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛为分析纯，购自Sigma公司；甲醇为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯试剂. 流动相使用前用0.45 mm滤膜过滤. 
天麻原药材购自四川省，并经中国中医研究院鉴定. 
1.2 色谱条件  ELSD和DAD检测均使用同样的色谱条件. 
色谱柱： Zorbax RX-SIL (4.6 mm i. d. ´ 25 cm, 5 mm)硅胶柱，HP公司产品；配有预柱Micro Pak SI-5 (4 mm i. d. ´ 4 cm, 5 mm)硅胶柱，Parker公司产品. 流动相：正己烷/甲醇/乙酸乙酯(体积比6:3:2)，流速0.8 mL/min；进样量20 mL；ELSD参数：漂移管温度65 ℃，氮气流速1.55 L/min；DAD检测波长270 nm。
1.3 样品处理  天麻干燥块茎粉碎后，准确称取100 g. 用70%的乙醇水溶液热回流3次，每次回流后再用超声提取. 提取液过滤后经浓缩得浓缩液. 浓缩液用甲醇稀释至适当浓度，放入冰箱冷冻。澄清液经0.45 mm滤膜过滤后直接进行HPLC分析。
1.4    标准溶液的配制  分别称取89.0 mg和21.3 mg的天麻甙溶于100 mL甲醇中配制成两个储备液. 使用前以甲醇稀释成适当浓度的工作溶液. 
2. 结果与讨论
2.1    天麻甙的分离    天麻的乙醇提取物中成分很多. 当流动相正己烷/甲醇/乙酸乙酯的体积比为5:3:2时，从DAD检测的色谱图来看，各种物质已经得到了较好的分离，但从ELSD检测色谱图上发现，天麻甙峰左侧有肩峰，说明有弱极性物质与天麻甙分离不完全，只是该物质在270 nm处无紫外吸收。增大正己烷比例，当正己烷/甲醇/乙酸乙酯的体积比达6:3:2时，无论从DAD检测结果〔图1(B)〕，还是ELSD检测结果〔图2(B)〕来看，提取物中的天麻甙与其他成分完全分离。从图1(B)可知，天麻提取物中的天麻甙元和对羟基苯甲醛与其后相邻的其他组分的分离不完全，因为本文的重点是比较ELSD和DAD检测天麻甙，故未对其它组分的分离条件进行优化。继续增大正己烷比例，各组分之间的分离度可进一步提高，但将导致分析时间过长。天麻甙也可以使用反相条件进行分离. 由于反相条件下，流动相中含水较多，ELSD工作时需要较高的漂移管温度和氮气气速，从而降低天麻甙的检测灵敏度. 故我们选用正相色谱条件来分离天麻甙. 天麻甙元和对羟基苯甲醛的挥发性较大， 即使在正相色谱条件下，也不能被ELSD检测.

      
Fig.1 The chromatograms of the standards(A) and ethanol extracts of Gastrodia elata Blume.(B) detected by DAD
1.  4-hydroxybenzyl alcohol;  2.  4-hydroxybenzaldehyde;  3.  Gastrodin.

    
Fig.2 The chromatograms of the standards(A) and ethanol extracts of Gastrodia elata Blume.(B) detected by ELSD
1. Gastrodin;   2.unknown.

3.2   ELSD条件优化  通过改变漂移管温度和氮气流速,选定在较小噪音水平上产生最大检测响应值的条件为:漂移管温度65 ℃，氮气流速1.55 L/min。
3.3   线性关系考察  将贮备液稀释配成21.3-890 mg/L的一系列浓度，依次进样20 mL，根据ELSD和DAD测得的峰面积对相应的标准溶液浓度进行线性回归。将最小浓度的标准溶液再逐级稀释，依次进样20 mL，计算当信噪比为3时，对应的标准溶液的浓度以确定检出下限。结果见表1. 
Table 1 Some parameters of gastrodin for quantitative analysis by ELSD and DAD
Detector Linear range /(mg L-1) Calibration curve Calibration coefficient (r) Detection limit / (mg L-1)
ELSD 21.3~890 Y=-56720.51+2534.46X 0.998 3.0
DAD 21.3~890 Y=-89.31+4.75X 0.999 1.0
3.4  天麻样品的测定  同一份样品重复进样5次，用ELSD和DAD测定其峰面积，取5次测定平均值计算样品中天麻甙含量. 在样品溶液中加入已知量的天麻甙标准溶液，测定回收率. 结果见表2. 

Table 2  Determination results of gastrodin in Gastrodia elata Blume by ELSD and DAD
Detector Mass fraction (%) Recovery (%) RSD (%)
ELSD 1.39 104.22 2.79
DAD 1.21 97.65 2.99
3.5  ELSD和DAD检测的比较  ELSD和DAD作为两种不同类型的检测器，其适用范围不尽相同. DAD所能检测的物质必须具有紫外吸收，而所采用的流动相应当在检测波长下无紫外吸收. 对于无紫外吸收的物质，可以通过衍生化的方法接上生色团. ELSD要求被测物比流动相难于挥发，对于一些半挥发性的物质，其检测灵敏度很低。同时，应当尽量避免使用高沸点的溶剂作为流动相. 对于一些分离中常加入的添加剂，如乙酸盐，磷酸盐等，ELSD检测时应用易挥发的盐来代替. 使用DAD和ELSD同时检测, 可以获得更多的物质信息, 且可以获得更准确的定量结果.

参考文献
1. FENG Xiao-Zhang (冯孝章), CHEN Yu-Wu (陈玉武), YANG Jun-Shan (杨峻山). Acta Chimica Sinica (化学学报), 1979, 37(3): 175-182
2. ZHOU Jun (周俊), PU Xiang-Yu (浦湘渝), YANG Yan-Bin (杨雁宾). Chinese Science Bulletin (科学通报), 1981, 26(18): 1118-1120
3. HUANG Jun-Hua(黄俊华), WANG Gui-Lian(王桂莲). Acta Acedemiae Medicinae Sinicae(中国医学科学院学报), 1985, 7(5): 399-402
4. TONG Chun-Yan (童春燕). Chinese J. Pharmaceutical Analysis (药物分析杂志), 1989, 9(3): 182-183
5. WANG Yue-Sheng (王跃生), LI Ji-Ping (李计萍), LIU Shu-Zhi (刘淑芝), et al. . China J. Chinese Materia Medica (中国中药杂志), 1998, 23(9): 541-543
6. Marcato B., Cecchin G. . J Chromatogr A, 1996, 730: 83-90
7. Clement A., Yong D., Brechet C.. J. Liq. Chromatogr., 1992, 15(5): 805-817
8. Park M. K., Park J. H., Han S. B., et al. . J. Chromatogr. A, 1996, 736: 77-81
9. TIAN Nan-Hui (田南卉), WANG Jie (王劼), LI Jin-Zhong (历进忠), et al. . Chinese J. Pharmaceutical Analysis (药物分析杂志), 1997, 17(4): 282-283
Determination of Gastrodin in Gastrodia elata Blume 
by HPLC with ELSD and DAD

WEI Yang,     DING Ming-Yu,      LI Hong-Xia  
(Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Abstract A normal-phase high performance chromatographic method  with evaporative light-scattering detector (ELSD) and diode array detector (DAD), using n-hexane/methanol/ethyl acetate (volume ratio 6:3:2) as mobile phase was established for the direct determination of active constituents—gastrodin (GA) in the ethanol extracts of Gastrodia elata Blume. An silica gel column Zorbax RX-SIL(4.6 mm i.d. ´25 cm, 5 mm) was employed. Regression equations revealed linear relationships (r= 0.998 and 0.999) between the peak areas of GA measured by ELSD and DAD and its concentration. The recoveries of GA measured by ELSD and DAD are 104.22% and 97.65%, respectively. The content of GA measured by ELSD and DAD are 13.9 mg/g (2.79% RSD) and 12.1 mg/g (2.99% RSD) respectively in Gastrodia elata Blume. The detection limits of ELSD and DAD (S/N=3) are 3mg/L and 1mg/L respectively. This method is simple, selective and sensitive.
Keywords High performance liquid chromatography; Evaporative light-scattering detector; Diode array detector; Gastrodin; Gastrodia elata Blume.