毛细管电泳法快速测定复方地芬诺酯片中的地芬诺酯和阿托品

　　【摘要】  　　建立了毛细管电泳高频电导法同时测定地芬诺酯和阿托品的方法。探讨了缓冲溶液、有机溶剂添加剂、分离电压和进样条件以及毛细管内径和长度等因素对分离检测的影响。在电泳介质为100 mmol/L乳酸15.0%C2H5OH、分离电压200 kV的优化条件下，6 min内即可实现地芬诺酯和阿托品的同时分离检测，线性范围分别为5.00～500和2.00～320 mg/L；检出限分别为3.0和1.0 mg/L。

　　【关键词】  毛细管电泳　高频电导检测　非接触式电导检测　复方地芬诺酯片　地芬诺酯　阿托品

　　1  引言

　　复方地芬诺酯片，又名复方苯乙哌啶和止泻宁[1] ，为2005年版《中国药典》收载[2]。地芬诺酯(Diphenoxylate)直接作用于肠平滑肌，抑制肠粘膜感受器而减弱肠蠕动，促进肠内水分的吸收，适用于急慢性功能性腹泻和慢性肠炎等。阿托品(Atropine)为典型的M胆碱受体阻滞剂。地芬诺酯长期服用易产生依赖性，配以阿托品，可协同加强对肠管蠕动的抑制作用，并抑制依赖性倾向，故临床常用两者的复方制剂。地芬诺酯的测定多采用高效液相色谱法[2]；阿托品的测定方法有高效液相色谱法[3]、分光光度法[2,4]、电化学法[5]和毛细管电泳法[6,7]等。尚未见毛细管电泳法同时测定盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品的报道。在弱酸性条件下，地芬诺酯和阿托品因质子化而带正电，可采用电导法检测。本实验采用毛细管电泳高频电导检测法，并成功地实现了复方地芬诺酯片中两组分的同时分离检测。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂高压电源，高频电导检测器自制[8,9]；石英毛细管(河北永年光纤厂)；数据工作站(中山大学化学与化学工程学院)；信号采集(台湾EVOC的PCL711B型A/D卡)。三(羟甲基)氨基甲烷(Tris, GR 香港分装)；盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品对照品(中国药品生物制品检定所)；其余所用试剂均为国产(AR)。水为去离子的二次蒸馏水。

　　2.2  实验方法

　　2.2.1  毛细管的处理  毛细管使用前依次用05 mol/L NaOH、水和缓冲液冲洗15 min，每2 h或更换新缓冲液时处理一次；每次进样前，依次用05 mol/L NaOH、水和缓冲液冲洗1 min。

　　2.2.2  电泳条件  毛细管长60 cm (150 μm i.d.)，有效长度51 cm，缓冲液100 mmol/L 乳酸15.0% C2H5OH。重力虹吸进样，进样高度25.0 cm，进样时间100 s，分离电压200 kV，实验在恒温(25℃)、恒湿(相对湿度60%)的条件下进行。

　　2.2.3  对照品溶液和样品溶液的制备  精确称取盐酸地芬诺酯对照品00100g，用乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中, 得1.00 g/L的对照品溶液，储于4℃冰箱。称取硫酸阿托品对照品00100 g，用乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中, 得1.00 g/L的对照品溶液，储于4℃冰箱。取复方地芬诺酯片50片，研细，称取适量，加20 mL乙醇，超声溶解10 min，过滤;取残渣加入20 mL乙醇，再次超声溶解10 min，过滤。合并两次滤液，用乙醇定容于50 mL容量瓶中，得供试品溶液，储于4℃冰箱。

　　3  结果与讨论

　　3.1  缓冲液的选择比较了NaH2PO4H3PO4、柠檬酸柠檬酸钠、TrisH3BO3、三乙胺H3BO3、环己胺H3BO3、氨水、柠檬酸、醋酸和乳酸等缓冲体系对地芬诺酯和阿托品分离效果的影响。结果发现， NaH2PO4H3PO4、柠檬酸柠檬酸钠和TrisH3BO3缓冲体系中目标组分均不出峰；在三乙胺H3BO3和环己胺H3BO3缓冲体系中只有阿托品出峰；在氨水、柠檬酸缓冲体系中只有地芬诺酯出峰；在醋酸和乳酸缓冲体系中地芬诺酯和阿托品都出峰；但在醋酸缓冲体系中出峰较晚，峰形较差；在乳酸缓冲体系中，阿托品和地芬诺酯峰形较好，峰较高，故选择乳酸缓冲体系进行优化分离。考察了不同浓度(5.0、100、15.0、200 mmol/L)的乳酸对分离检测效果的影响，综合考虑迁移时间、峰形和分析灵敏度等因素，选择100 mmol/L乳酸为运行缓冲溶液。

　　3.2  有机溶剂种类和浓度的选择在100 mmol/L乳酸缓冲体系中，地芬诺酯和阿托品均出峰，但不能完全分离，见图1(A)。实验通过加入有机溶剂添加剂改善分离度。比较了不同种类(甲醇、乙醇、乙腈及丙酮)有机溶剂对分离测定的影响。结果表明，选用适当比例的乙醇可在较快分析速度的条件下，有效提高分离度，使地芬诺酯和阿托品达到基线分离，见图1(B)。比较了添加0～300% (Ｖ／Ｖ)乙醇对分离的影响，结果发现，随着乙醇比例的增加，电渗流变小，阿托品和地芬诺酯的出峰延迟，分离度和峰高先逐渐增加(乙醇比例0～15.0%)，后趋于平稳(乙醇比例15.0%～300%)。综合考虑，选择15.0 %乙醇作为有机添加剂。

　　图1  缓冲溶液中加入乙醇前(A)后(B)地芬诺酯和阿托品的毛细管电泳图（略）

　　Fig.1  Electropherogram of diphenoxylate and atropine before (A) and after (B) addition of C2H5OH

　　分离电压(separation voltage)：200 kV；进样高度(injection height): 25.0 cm；进样时间(injection time) 100 s；缓冲溶液(buffer solution): A.100 mmol/L lactic acid，B. 100 mmol/L lactic acid ＋15.0% C2H5OH；1.阿托品(atropine) 50 mg/L； 2. 地芬诺酯(diphenoxylate) 60 mg/L； 3. C2H5OH。

　　3.3  分离电压和进样量的选择在14.0～26.0 kV分离电压下进样分析。结果表明，提高电压可以提高分离度和加快分析速度。但电压太高时，体系产生的焦耳热增加，基线噪音大幅度增加，分离度变差，不利于分离。优化条件为200 kV。实验采用重力虹吸进样，进样量同时受进样高度和进样时间的影响。进样量太小时检测器难以检出；进样量过大时往往会导致区带展宽，使分离度变差。综合考虑，优化的进样时间为10 s，进样高度为25.0 cm。

　　3.４  线性范围、检出限和重现性在优化条件下，地芬诺酯和阿托品对照品溶液的毛细管电泳图见图1(B)。盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品的浓度(X：mg/L)和峰面积(Y)分别在5.00～500和2.00～320 mg/L范围内线性关系良好，线性回归方程分别为Y＝32.8+123X(r＝09997)和Y＝29.4+203X(r＝09991)，检出限分别为3.0和1.0 mg/L(S/N=3)。在优化条件下，分别以盐酸地芬诺酯(600 mg/L)、硫酸阿托品(500 mg/L)对照品溶液重复进样6次测定相应的峰面积，峰面积的RSD分别为1.6%和2.0%。

　　3.５  样品分析在选定的优化条件下，取复方地芬诺酯片剂样品溶液适当稀释后进样测定。根据线性回归方程计算出片剂中盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品的含量分别为2.39 mg/片和0024 mg/片(片剂中地芬诺酯和阿托品的标示量分别为2.5 mg/片和0025 mg/片)。分别将两种对照品溶液与样品溶液按不同比例混合，测得标准加入回收率结果见表1,结果令人满意。

　　表1  样品加标回收率(n=6)（略）

　　Table 1  Recoveries of standard addition (n=6)

　　【参考文献】

　　1 Zhou Jing(周 静). Adverse Drug Reaction Journal(药物不良反应杂志), 2005, 5: 351～353

　　2 Editorial Committee of the Pharmacopoeia of Republic of China (中华人民共和国卫生部药典委员会). The Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, Part Ⅱ. (中华人民共和国药典(二部) ). Beijing(北京) : Chemical Industry Press(化学工业出版社), 2005: 425

　　3 Guo Ruifeng(郭瑞峰), Qi Fang(齐 芳), Qie Bingbing(郄冰冰). Chinese Journal of Pharmaceutical(中国医药工业杂志), 2005, 36(1): 38～40

　　4 Qu Yue(屈 悦). China Pharmacist(中国药师), 2005, 8(5): 436～437

　　5 Lin Hong(林 洪), Guo Wei(过 玮), Zhao Hongan(赵宏安), Song Junfeng(宋俊峰). Chinese Journal of Analysis Laboratory(分析试验室), 2001, 20(6): 29～31

　　6 Ｂo T, Li K, Liu H W. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 31(5): 885～891

　　7 Cherkaoui S, Mateus L, Christen P, Veuthey J L. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1998, 17(67): 1167～1176

　　8 Chen Z G, Mo J Y, Yang X Y, Wang L S, Mei X T, Zhang M S. Chin. Chem. Lett., 1999, 10(3): 231～234

　　9 Chen Zuanguang (陈缵光), Mo Jinyuan(莫金垣). Chem. J. Chinese Universities(高等学校化学学报), 2002, 23(5) : 801～804