高效毛细管电泳法测定姜黄中姜黄素类化合物

　　                                                           来源：中国色谱技术网

　　摘要：用高效毛细管电泳法测定姜黄中姜黄素类化合物的含量；姜黄素类化合物毛细管电泳谱图的峰面积和浓度具有良好的线性关系；方法的精密度RSD为1.12%～2.47％(=5)，平均回收率为97．5%～98．1%。

　　关键词：高效毛细管电泳法；姜黄；姜黄素类化合物

　　姜黄(CurcumalongaL．)是一种常用中药，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗病毒等药理作用。从姜黄中用乙醇提取的姜黄素类化合物的主要成分有姜黄素curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和双去甲氧基姜黄素(bis．demethoxycurcumin)3种IJ，其分子结构式见图。

　　姜黄素类化合物由于结构上的差异使其在药理上的作用有所不同，例如去甲氧基姜黄素抑制TPA引起的癌细胞增生效果最佳；双去甲氧基姜黄素在防止细胞脂类过氧化物的形成上强于姜黄素和去甲氧基姜黄素，所以姜黄素类化合物的提取、分离和测定对姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素药理性能的研究及开发具有重要的应用价值。姜黄素类化合物是中药姜黄的主要有效成分，检测姜黄及其制剂中姜黄素类化合物的含量是衡量其质量好坏的一项主要指标。测定姜黄素的方法有分光光度法、薄层色谱法、极谱催化波法、库仑滴定法；测定姜黄素类化合物的方法有高效液相色谱法等，而用高效毛细管区带电泳法测定姜黄素类化合物还未见报道。为此，我们通过实验研究，建立起了用高效毛细管区带电泳分离测定姜黄素类化合物的新方法。与高效液相色谱法相比，本法具有简便、快速、准确，消耗试剂少，测试费用低，不污染环境等优点。适用于姜黄及其制剂中姜黄素类化合物的测定，可为姜黄及其制剂的内在质量控制以及姜黄素类化合物的药理性能研究提供参考数据。

　　1、实验部分

　　1．1仪器与试剂：TH-2型高效毛细管电泳仪(河北大学研制)；弹性石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件有限公司)；UV-3000型双波长／双光束紫外一可见分光光度计(日本岛津公司)；Phs-3C(601B)型数字式酸度计(江苏电分析仪器厂)；AD一4型自动电子天平(美国Perkin-Elmer公司)。

　　在索氏提取器中用95％()乙醇从10g姜黄粉中把姜黄素类化合物完全提取出来，得到棕红色的乙醇溶液，用石油醚把姜黄油从棕红色的乙醇溶液中萃取分离后，定量转移到100mL容量瓶中。加95％乙醇定容，得到姜黄素类化合物的乙醇提取液。

　　分析纯的姜黄素(上海化学试剂三厂)，用高效毛细管电泳仪经归一化法测定其含量为99.3％，可作为对照品使用。

　　去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素均是从姜黄素类化合物的乙醇提取液中用薄层板分离提纯出的样品，用高效毛细管电泳仪经归一化法分别测试其含量，去甲氧基姜黄素为98.7％，双去甲氧基姜黄素为98.5％，可作为对照品使用。

　　所用其它试剂皆为分析纯；水为电渗析后的二次蒸馏水。

　　1．2实验方法：弹性石英毛细管柱75μID×50cm；电泳电压15kV；电极极性由正到负；紫外检测波长34nm；毛细管柱温20℃采用压力进样，进样压力5kPa，进样时间3s。缓冲溶液30mmol／L硼砂-l0mmol／LHa2HPO4-30％(φ)乙腈(pH=9．60)。开机前先用0．1mol／LNaOH溶液气压冲洗毛细管柱10min，再依次用双蒸水、缓冲溶液各冲洗5min。开机后在l5kV下运行缓冲溶液，直至基线平稳后才能进样。每次测试完成后，均用缓冲溶液冲洗毛细管柱2min，每进样3次后更新缓冲溶液。测试溶液须先经0．45μm微孔滤膜过滤，然后才能气压进样。准确移取姜黄素类化合物乙醇提取液0．3mL于1mL容量瓶中，用95％的乙醇定容。在5kPa的压力下气压进样，记录其毛细管电泳谱图。

　　2、结果与讨论

　　2．1电泳电压

　　加大毛细管柱两端的电泳电压能够缩短分析时间。但当电压增加到一定程度时，焦耳热不易散发，使缓冲溶液粘度降低，迁移率增加，姜黄素类化合物的分离度下降。另外电泳电压加大后，还会使仪器的噪音明显增大。综合考虑，本实验选用l5kV的电泳电压，既能使姜黄素类化合物有较好的分离度和较快的迁移时间，又保持了仪器的低噪音。

　　2．2毛细管柱温

　　毛细管柱温度较低时，缓冲溶液粘度增大，姜黄素类化合物的迁移时间延长，且峰形展宽；温度较高时，缓冲溶液粘度减小，迁移率增加，分离度下降。温度为20℃时，姜黄素的迁移时间为2lmin左右，姜黄素类化合物的峰形和分离度均较好，所以毛细管电泳的柱温确定在2o℃。

　　2．3检测波长

　　有文献报道姜黄素乙醇溶液最大吸收波长为430nm。由于TH-2型高效毛细管电泳仪检测波长范围是200～400nm内连续可调，我们把姜黄素乙醇溶液加到缓冲溶液中进行紫外光谱扫描，结果姜黄素在348咖处有最大吸收，所以选择348舢作为毛细管电泳的检测波长。

　　2．4缓冲溶液

　　因在硼砂水溶液中，四硼酸根离子解聚出的硼酸可以和姜黄素类化合物发生反应生成络合物。故分别用20、30、40mmol／L不同浓度的硼砂溶液考察浓度对姜黄素类化合物分离度的影响。硼砂浓度为20、30mmol／L时，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素不能很好地分离；浓度为40mrnol／L时，迁移时间延长，有较好的分离效果，但仍没有达到基线分离。

　　有机添加剂能有效地改善分离度，所以在40mmol／L硼砂溶液中添加10％、20％、30％的乙腈，

　　考察其分离情况。结果表明，加乙腈10％、20％，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素不能基线分离；当加乙腈30%，才能进行基线分离，但需30min左右才能出完峰，不利于快速分析。为减少出峰时间，降低40mmol／L硼砂溶液的浓度，添加一定量的磷酸盐，用磷酸盐代替部分硼砂后，不仅不会影响组分的分离度，而且还可以提高被测组分的迁移率，缩短出峰时间。实验表明：在30mmol／L硼砂-10mmol／LNa2HPO4-30％乙腈实验条件下，姜黄素类化合物的3个组分能够基线分离，出峰时间缩短为21min，所以选择此缓冲溶液。

　　缓冲溶液的酸碱度直接影响被测物质的带电性，从而影响其分离度。由于姜黄素类化合物含有酚羟基，其酸性较弱。在pH>9．00时，酚羟基才开始解离；在pH=9．60时，姜黄素类化合物能够基线分离；在pH≥10．0时，姜黄素类化合物迁移时间延长，且峰形变差；所以缓冲溶液的pH值确定在9．60。姜黄素类化合物的毛细管区带电泳谱图如图2所示。

　　2．5标准曲线及精密度

　　精确称取姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素对照品12．26、12．15、12．21mg，先用95％乙醇溶解，再用1O瑚L容量瓶定容，得到质量浓度分别为1．226、1．215、1．221g／L对照品储备液。移取0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL储备液于lmL小容量瓶中，再用95％乙醇分别稀释到刻度。在选定的实验条件下，每个浓度溶液进样3次，计算其峰面积的平均值。以进样浓度为横坐标，用表示，单位是g／t,；以峰面积为纵坐标，用y表示，单位是mm2，再根据峰面积和含量的相互关系求出其线性回归方程。姜黄素的线性回归方程为Y=580．196X-0．715，r=0．9996(n=6)，线性范围0．24521．226g／L；去甲氧基姜黄素为Y=478．235X-0．522，r=0．9998(n=6)，线性范围0．2430～1．215g／L；双去甲氧基姜黄素为Y=438．124X-0．373，r=0．9998(n=6)，线性范围0．2442～1．221g／L。由此可见，姜黄素类化合物的峰面积和浓度有良好的线性关系。

　　按实验方法连续测姜黄素类化合物95％乙醇溶液5次，计算出3个组分的RSD，其结果分别是姜黄素1．27％，去甲氧基姜黄素1．12％，双去甲氧基姜黄素2．47％。

　　2．6回收率实验

　　准确称取姜黄3份各10g，分别加入姜黄素105．76nag，去甲氧基姜黄素72．48nag，双去甲氧基姜黄素60．25nag，按实验方法每份溶液连续测定3次，计算其回收率。测定结果见表1。

　　2．7姜黄中姜黄素类化合物含量的测定

　　按实验方法气压进样，连续测定5次，分别计算出姜黄中姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素在姜黄中的含量。