高效液相色谱法测定顽痹通胶囊中士的宁的含量

　　摘　要　目的：建立测定顽痹通胶囊中士的宁含量的高效液相色谱法。方法：采用高效液相色谱法。以ZORBAX RX-SIL(150mm×4.6mm 5μm)为色谱柱；流动相：正已烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨水(270∶270∶20∶1.7)；检测波长：254nm；流速：1.0ml^.min^-1。结果：士的宁的加样回收率为97.82%，RSD为1.85%（n=5）。结论：该方法准确、灵敏度高，重现性好。
关键词　顽痹通胶囊；士的宁；高效液相色谱法
中图分类号　R927.2

DETERMINATION OF STRYCHNINE IN WANBITONG CAPSULES BY HPLC

Cao Hong，Li Kai，Liu Yun
(Institute for Drug and Instrument Control of PLA,Beijing　100071)

　　Abstract　AIM To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for determination of strychnine in wanbitong capsules.METHODS Silica gel was used as the stationary phase,n-hexane-dichloromethane-methanol-ammonia(270∶270∶20∶1.7)as the mobile phase,with detection wavelength at 254nm and the flow rate of 1.0ml per minute.RESULTS The mean recovery of strychnine in wanbitong capsules was 97.82% and RSD was 1.85%.CONCLUSION This method was reliable and accurate.
　　Key words　Wanbitong capsules;Strychnine;HPLC

　　顽痹通胶囊是由马钱子、白芍等十多味中药组成的复方制剂。具有活血化瘀，补气养血之功效。临床上用于风湿、类风湿性关节炎等的治疗。君药马钱子中的有效成分士的宁、马钱子碱均有剧毒，必须严格控制其含量。本文采用正相高效液相色谱法，测定复方制剂中士的宁（Strychnine）的含量，以控制成药的质量，效果良好，定量准确，快速。

1.仪器与试药
1.1　仪器　高效液相色谱仪：惠普HP-1050四元梯度泵；HP-1050 DAD检测器；HP化学工作站（美国惠普公司）；HP DeskJet 500Q打印机。
1.2　试药　士的宁对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号 0705-9304）。顽痹通胶囊(空军类风湿病专科中心提供，批号 981202，981217，981230)。正已烷、甲醇为色谱纯；二氯甲烷、浓氨水等其它试剂均为分析纯。

2　实验方法与结果
2.1　色谱条件　ZORBAX RX-SIL分析柱（150mm×4.6mm 5μm）；流动相：正已烷－二氯甲烷-甲醇-浓氨水(270∶270∶20∶1.7)；检测波长：254nm（带宽2nm）；参比波长：550nm（带宽100nm）；流速：1.0ml^.min^-1；柱温：40℃。
按以上色谱条件得到样品、对照品、阴性对照液分离色谱图，见图1。

图1　顽痹通胶囊HPLC色谱图
A 阴性对照液　B 士的宁对照品　C 样品

2.2　方法学考察
2.2.1　色谱峰纯度检测　将士的宁对照品溶液和样品溶液注入高效液相色谱仪，应用二级管阵列检测器和色谱工作站，测得样品色谱中士的宁的色谱峰峰纯度系数大于995。
2.2.2　色谱峰光谱一致性检测　应用二级管阵列检测器和色谱工作站，对样品中士的宁色谱峰和对照品中士的宁色谱峰进行光谱扫描，结果两者光谱吸收图谱基本一致，见图2。

图2　士的宁色谱峰的光谱吸收图

2.2.3　样品溶液稳定性试验　取供试品溶液，分别于配制后0、0.5、1、2、3、5、8h，依样品测定法测定，结果表明，供试品溶液基本稳定。见表1。

表1　供试品溶液稳定性试验结果

时间（h）

峰面积

RSD（%）

0

918

0.5

929

1

923

2

934

924

0.81

3

931

5

922

8

913

2.2.4　精密度试验　精密吸取士的宁对照品溶液10μl，重复进样6次，测量峰面积，结果见表2。

表2　士的宁对照品溶液的精密度试验结果

次数

峰面积

RSD（%）

1

1000

2

992

3

998

997

0.58

4

998

5

990

6

1006

2.2.5　线性关系的考察　精密吸取士的宁对照品溶液(50μg^.ml^-1)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分别置于10ml量瓶中，加醋酸乙酯稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取各对照品溶液10μl，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，士的宁进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
Y=2168.25761X+22.9972，r=0.9995（n=5）。
结果表明，士的宁在0.1165～0.9320μg范围内呈线性关系。
2.2.6　重现性试验　按样品测定方法测定，对同一批样品（批号 981217）重复测定5次，结果见表3。

表3　顽痹通胶囊中士的宁重现性试验结果

称样量
（g）

士的宁含量
（mg/粒）

平均含量
（mg/粒）

RSD
（%）

0.4657

0.5332

0.4948

0.5566

0.5002

0.5574

0.5501

1.93

0.4992

0.5575

0.5037

0.5460

2.2.7　空白实验　按处方量制备缺马钱子药材的阴性对照液，照样品测定方法操作，结果空白溶液在与士的宁对照品相同保留时间处，未显示明显色谱峰，认为无干扰，见图1 A。
2.2.8　加样回收率试验　精密称取已知含量的同一批样品（批号 981217）0.25g ，精确加入士的宁对照品，按样品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率，测定结果见表4。

表4　顽痹通胶囊中士的宁的加样回收率试验结果

称样量
（g）

相当士的
宁的量（mg）

加入士的
宁的量（mg）

测得量
（mg）

回收率
（%）

（%）

RSD
（%）

0.2556

0.5638

0.5530

1.1060

98.05

0.2741

0.6046

0.5530

1.1486

98.37

0.2412

0.5320

0.5530

1.0652

96.42

97.82

1.853

0.2398

0.5289

0.5530

1.0588

95.82

0.2527

0.5574

0.5530

1.1128

100.43

3　样品测定
3.1　样品溶液的制备　取本品20粒，精密称定，取内容物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中。加浓氨水2ml使润湿，精密加入氯仿25ml，密塞，称定重量，室温放置24h，称定重量，用氯仿补足减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取滤液10ml，置分液漏斗中，用硫酸溶液（3→100）提取5次，每次20ml，合并硫酸液，加浓氨水使成碱性（pH 10），用氯仿提取5次，每次20ml，合并氯仿提取液，水浴蒸干。残渣用醋酸乙酯溶解至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.5μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
3.2　对照品溶液的制备　精密称取士的宁对照品，加醋酸乙酯制成50μg^.ml^-1的溶液，作为对照品溶液。
分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件，以外标法计算含量。
3.3　样品测定结果　按样品测定方法测定3批成药样品，结果见表5。

表5　顽痹通胶囊中士的宁含量测定结果（n=3）

批　　号

士的宁含量（mg/粒）

981202

0.5527

981217

0.5501

981230

0.5361

4　讨　论
4.1　供试品溶液提取方法的选择　曾采用浓氨水2ml润湿，25ml氯仿浸渍24h，滤过后，滤液蒸干。残渣加醋酸乙酯10ml定容，直接进样测定，结果在士的宁出峰处有干扰；直接测定马钱子碱没有干扰，且马钱子碱含量很高。经过反复萃取后，马钱子碱损失较多，已无法准确定量，可能是由于马钱子碱不易溶于硫酸溶液中，故含量测定时未列入马钱子碱。
4.2　对马钱子中士的宁的含量测定方法，文献报道有高效液相色谱法^［1～3］、薄层扫描法^［4］、计算分光光度法^［4］等，其中以高效液相色谱法较为简便、准确。对流动相的选择：为了准确测定样品中士的宁的含量，排除干扰，减少了流动相中甲醇的比例，达到基线分离的效果。在配制流动相时，可先将甲醇与浓氨水按比例混匀，再加入二氯甲烷，最后加入正已烷。

作者简介：曹红，女，医学硕士，副主任药师。
李凯，第一军医大学中药专科96级实习学生。

作者单位：中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所　北京　100071

参考文献：
1　徐丽华，鲁静.HPLC法测定马钱子及其制剂中士的宁与马钱子碱的含量.药物分析杂志，1998；18（6）：383
2　张振秋，沙明，袁昌鲁等.HPLC法测定马钱子及伤科七味片中士的宁与马钱子碱的含量.中草药，1998，29（4）：236
3　梁宏.HPLC法测定九分散中麻黄碱、伪麻黄碱和士的宁的含量.药学学报，1990；（11）：849
4　中国药典委员会.中华人民共和国药典.一部.北京：北京化学工业出版社，1995；372，409，39

(本文编辑　梁爱君)

收稿日期：1999-05-18
修改日期：1999-08-05