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(*广州军区武汉总医院，武汉，430070；a同济医科大学药学院，武汉，430030)
摘要 目的：建立分离测定血浆中普罗帕酮(PPF)对映体浓度的HPLC方法，为临床PPF对映体的药动学研究提供科学的分析技术。方法：使用乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)作为手性衍生化试剂，产生非对映异构体，后采用反相高效液相色谱法，以含0.01%冰醋酸的乙腈椝?/FONT>(3:2)作为流动相，进行分离测定。采用内标法，紫外检测波长为210nm。结果：实验表明，R-PPF与S-PPF及内标的分离良好，准确性好。日内、日间的RSD均小于11%。血药浓度在50ng× ml- 1~500ng× ml- 1范围内与PPF/I.S.峰面积比呈线性关系，r>0.996。结论：本方法具有较高的准确度，方法灵敏，专一性好，并证明适用于PPF的药动学研究。
关键词：普罗帕酮；手性衍生化；GITC试剂
普罗帕酮(Propafenone，简称PPF)，属于Ic类抗心律失常药，在PPF分子的氨基丙醇基的侧链上含有一个不对称碳原子，在构型上可分为(R)- PPF、(S)- PPF两种光学异构体。由于其对映体(Enantimers)的立体构型不同，它的药理效应[1，2]和/或药代动力学特征[3，4]也可能不同，即表现立体选择性(Stereo-selectivity)。为进行相关的药动学研究，必须建立有效的血浆中PPF拆分和测定手段。我们主要参照Mehvar R.[5]和周晔[6]的报道，建立了GITC柱前衍生化法测定血浆中PPF对映体的方法。
1 仪器和试剂
日立HPLC系统：日立655A-12泵；655A-22型可变波长紫外检测器；D-2000数据处理器；7161进样阀。
PPF原料：(R/S)- PPF盐酸盐(药用，批号951010)太仓制药厂；PPF标准品：(R/S)- PPF、(R)- PPF、(S)- PPF标准品，内标标准品：2- (2¢ - 羟基- 3¢ - 乙胺丙氧基)- 3- 苯基苯乙基酮(简称Li- 1115)，由德国Stuttgart市 Dr. Margarete-Fisch-Bosch临床药理研究所捐赠；柱前衍生手性试剂GITC购于美国Sigma化学公司。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 固定相为Spherisorb ODS Ⅱ(4.6×250mm, 5m m)；柱温、室温；流动相为乙腈- 水(3:2)，每升混合液中加入100m l冰醋酸；流动相流速1.0ml/min，进样16min后改为1.5ml/min；紫外检测波长210mm；灵敏度0.01AUFS；记录纸速2.5mm/min；进样量20m l。在该色谱条件下，色谱柱的理论搭板数n=4986；PPF对映体分离度R=1.58；拖尾因子T=0.96。
2.2 试液和标准贮备液的配制 配制(R/S)- PPF溶液(10ng/m l甲醇)；(S)- PPF溶液(5ng/m l甲醇)；(R)- PPF溶液(5ng/m l甲醇)；内标Li-1115溶液(20ng/m l甲醇)；Tris缓冲液(0.1M取三羟甲基氨基甲烷12.1g溶于1000ml水中，用NaOH液(4g→10ml)调节pH12)；GITC试液(1mg/ml乙腈)；人体、空白血浆；在武汉市血库中心的帮助下，抽取一未服任何药物的健康青年男性全血，离心分离出血浆，置于- 30℃保存。
2.3 血浆中PPF的提取方法 取含药血浆1ml，置10ml离心管中，加入20m l内标Li 1115溶液(20ng/m l甲醇)，500m l Tris缓冲液，再加入5ml二氯甲烷，用快速混匀旋涡器混旋提取1分钟，以3000转/min的速度离心分离10分钟，将有机层转移到另一试管中，氮气流吹干(水浴温度<40℃)，得PPF和内标残留物。
2.4 衍生化反应 在上述残留物中加入40m l GITC试液，加入60m l乙腈，用快速混匀旋涡器混旋1分钟，室温放置40分钟使衍生化反应完全，氮气流吹干(水浴温度<40℃)。再加入40m l流动相，用快速混匀旋涡器混旋1分钟使溶解，取20m l注入色谱系统。
2.5 色谱行为 在本测试条件下，(S)- PPF、(R)- PPF、内标Li-1115均有足够大的峰高，血浆杂质峰无干扰，内标1峰，内标2峰(对映体)、(S)- PPF峰、(R)- PPF峰的保留时间分别为10.3、11.3、13.1、14.2min，各峰之间有较好的分离度(图1)。仪器最小检出值(上柱实测值)为(S)- PPF或(R)- PPF2ng。因内标标准品为一消旋体，经衍生化后也有2个峰并得到好的分离，可任选一峰或两峰加和作内标，本文选内2峰作内标信号。
2.6 标准曲线的制备 A：(S)- PPF或(R)- PPF的标准曲线：分别取(R/S)- PPF溶液(10ng/m l甲醇)10、20、40、80、100m l置10ml离心管中，得(S)- PPF和(R)- PPF含量各为50、100、200、400、500ng的标准系列，加入20m l内标Li-1115溶液(20ng/m l甲醇)，用快速混匀旋涡器混旋后用氮气流吹干(水浴温度<40℃)，得PPF和内标残留物。按步骤“4”进行衍生化反应，各取20m l注入色谱系统。同时做空白。平行做3份。分别以R- PPF峰、S- PPF峰与内标2峰的峰面积比，相对投入量作回归，得回归方程如下：
(S)- PPF：Y(峰面积比)=0.005568X(ng/ml)- 0.09608 (r=0.9993)
(R)- PPF：Y(峰面积比)=0.005715X(ng/ml)- 0.1051 (r=0.9999)
B：血浆中提取(S)- PPF或(R)- PPF的标准曲线：取空白血浆各1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)- PPF溶液(10ng/m l甲醇)10、20、40、80、100m l，得血浆中(S)- PPF和(R)- PPF含量各为50、100、200、400、500ng/ml的含药血浆标准系列。按步骤“3，4”进行提取和衍生化反应，各取20m l注入色谱系统。同时做空白。平行做3份。分别以R- PPF峰、S- PPF峰与内标2峰的峰面积比，相对投入量作回归，得回归方程如下：
(S)- PPF：Y(峰面积比)=0.005822X(ng/ml)- 0.08712 (r=0.9963)
(R)- PPF：Y(峰面积比)=0.005711X(ng/ml)- 0.08772 (r=0.9975)
2.7 血浆中(S)- PPF和(R)- PPF的提取率 取空白血浆各1ml置10ml离心管中，再分别加入(R/S)- PPF溶液(10ng/m l甲醇)10、40、100m l，平行做4份，得血浆中(S)- PPF和(R)- PPF含量各为50、200、500ng/ml的含药血浆。按步骤“3”进行提取(但内标改在“氮气流吹干”前加入)，按步骤“4”进行衍生化反应，各取20m l注入色谱系统。同时做空白。分别以R- PPF峰、S- PPF峰与内标2峰的峰面积比，代入未经提取的(S)- PPF或(R)- PPF的标准曲线(见步骤“6- A”)，得提取后浓度，与投入量相比，即得(S)- PPF和(R)- PPF的血浆提取率(表1)。
2.8 精密度和相对回收率 取空白血浆各1ml置10ml离心管中，再分别加入(R/S)- PPF溶液(10ng/m l甲醇)10、40、100m l，平行做4份，得血浆中(S)- PPF和(R)- PPF含量各为50、200、500ng/ml的含药血浆，按步骤“3”进行提取，按步骤“4”进行衍生化反应，各取20m l注入色谱系统。同时做空白。分别以R- PPF峰、S- PPF与内标2峰的峰面积比，代入血浆中提取的(S)- PPF或(R)- PPF的标准曲线(见步骤“6~B”)，得测得浓度。计算得日内RSD和相对回收率(表1)。相隔一周，重复上述步骤，连续做4天(每天各做1份)，得日间RSD(表1)。
2.9 本方法在后续的“PPF对映体在中国汉族人体内药代动力学研究”中应用情况良好，健康志愿者口服(R/S)-PPF HCl片(150mg/次，1次/6小时)连续给药4天，在第4天给药后2小时抽取血样，按上述方法，HPLC检测得实测点图谱如图2 B。其中“A 当日质控点”系同时操作的血浆中(R/S)-PPF HCl标准品阳性对照，用以减少提取方法及tR误差。从实测点已可以看出，(R)-PPF峰(d峰)明显低于(S)-PPF峰(c峰)，提示(R)-PPF与(S)-PPF在人体内的药动学存在差异(表1)，详细资料有待进一步研究后另文报道。
表1 血浆中PPF提取率、回收率、精密度和样品测定结果(n = 4)
|
PPF(ng/ml) |
(S)-PPF |
(R)-PPF | |||||
|
50 |
200 |
500 |
50 |
200 |
500 | ||
|
血浆提取率 (%) |
83.05± 7.82 |
82.52± 6.15 |
83.79± 3.81 |
83.40± 6.98 |
84.59± 4.00 |
84.50± 3.63 | |
|
相对回收率 (%) |
97.02± 8.89 |
101.82± 5.85 |
99.31± 2.20 |
96.51± 10.45 |
102.69± 7.05 |
98.88± 2.26 | |
|
日内 RSD(%) |
9.17 |
5.75 |
2.21 |
10.83 |
6.86 |
2.27 | |
|
日间 RSD(%) |
7.67 |
3.77 |
2.05 |
6.74 |
10.72 |
3.21 | |
|
实测点 (ng/ml) |
272.35± 88.62 |
168.95± 52.37 |
|||||
3 讨论
3.1 与Mehvar R.[5]法相比，本文改衍生剂R(- )- 乙萘异氰酸酯为国内常用、可合成的GITC，同时简化了提取方法，并改用Li-1115作内标。建立的方法灵敏、简便。
3.2 经筛选，我们确定流动相为乙腈- 水(3:2)，每升混合液中加入100m l冰醋酸。经考察，含乙腈比例增加，有利洗脱，GITC × PPF出峰快；含水比例增加，有利于保留，出峰时间延长。另外，环境温度升高有利洗脱。因采用硅烷化柱，pH要求2- 7，故加100m l冰醋酸，使流动相显弱酸性，经考察，流动相中冰醋酸加入量在0~100m l，GITC × PPF出峰时间不受影响。
3.3 衍生化反应原理系PPF消旋体和GITC手性试剂反应后形成非对映异构体，产生性质差异，而进行色谱分离。GITC试剂性质活泼，应避光防潮，密闭冷藏。我们曾用甲苯作为GITC的反应溶剂，衍生化反应令人满意，但吹干后残留的少量甲苯随样品进入色谱系统后可在接近内标峰处出现一个大峰，后改用乙腈作反应溶剂则无此现象。我们考察了衍生化反应与反应时间的关系。确认GITC与PPF和内标的衍生化在40分钟后反应完全，2小时内稳定。其峰面积比20分钟后即可稳定。
3.4 因衍生化反应的缘故，HPLC血清杂质峰的保留时间大大延长，流速为1ml × min- 1时，最后一个血清杂质峰在90min时洗脱完毕。为缩短全程时间，可在进样16min后改流速1.5ml × min- 1，则血清杂质峰在60min洗脱完毕。如泵压允许，在另做标准曲线时，可提高全程流速至2 ml × min- 1，使血清杂质峰在更短时间的洗脱完毕。
参考文献
Resolution and determination of propafenone enantiomers in human plasma using chiral derivatization and reversed-phase liquid chromatography
Zhang Yi*, Chen Ying*, Qiu Juna, Li Gaoa, Tian Shixiona
Guangzhou Military Region Wuhan General Hospital, Wuhan 430070; aPharmacy College, Tongji Medical University, Wuhan 430030
ABSTRACT Objective: To establish a convenient and sensitive HPLC method for separation and determination of the enantiomers of propafenone (PPF) in human plasma, and to provide scientific analysis for the studies of the pharmacokinetics when the Chinese take PPF enantiomers. Method: The method was based on derivatization with the chiral reagent 2,3,4,6-tetra-o-acetyl-b -D-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC), and resolution of the resulting diastereomeric thioureas by reversed-phase HPLC using acetonitrite-water (3:2) containing 0.01% acetic acid as the mobile phase. It’s detected at 210nm. Internal standard was Li-1115. Results: The separation of the PPF enantiomers and I.S. was proved to be highly satisfactory. The accuracy (percentage error) was excellent. Both RSD of intra-day and inter-day were less than 11%. The assay linearity was determined over the range of 50ng× ml- 1 ~ 500ng× ml- 1 in plasma (r>0.996). Conclusion: This method possesses high accuracy and precision, and is sensitive and specific. The applicability of the assay to the pharmacokinetic studies of the enantiomers of PPF is also demonstrated.
Key words: Propafenone; Chiral derivatization, GITC reagent
第一作者简介：
张宜，男，1966年8月出生，医学硕士，现任广州军区武汉总医院药剂科 主管药师。