高效毛细管电泳法研究盐酸司来吉兰的手性分离

摘要　目的：采用高效毛细管电泳法分离盐酸司来吉兰的对映体。方法：对影响分离的手性选择剂、运行缓冲液等进行了系统的研究。结果：用含20 mmol^．L^-1羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)，50 mmol^．L^-1磷酸盐缓冲液(pH4.7)作运行缓冲液，使盐酸司来吉兰对映体获得基线分离。结论：本法可应用于测定盐酸司来吉兰片中左旋异构体含量。
关键词　盐酸司来吉兰　对映体　手性分离　高效毛细管电泳　羟丙基-β-环糊精

Study on the Chiral Separation of Selegiline
Hydrochloride by Capillary Electrophoresis

Huang Zongyu，Jin Ou and，Jiayi
(Zhejiang Institute for Drug Control,Hangzhou　310004)

Abstract　Objective：Chiral separation of selegiline hydrochloride was studied by capillary electrophoresis using HP-β-CD as the chiral selector.Method:Both complexation and resolution were affected by the CD type,CD concentration and the pH of electrolyte.The influence of working voltage and capillary temperature on the enantiomeric separation was also investigated.Results:HP-β-CD was superior to β-CD and α-CD for the separation of D and L-selegiline hydrochloride.The pH of electrolyte was 4.7.The concentration of HP-β-CD was 20 mmol^．L^-1.Conclusion:The proposed method can be applied to the assay of L-selegiline in selegiline hydrochloride and its tablets.
Key words　selegiline hydrochloride,enantiomer,chiral separation,HPCE,HP-β-CD

　　盐酸司来吉兰(Selegiline hydrochloride)为选择性β型单胺氧化酶抑制剂，能抑制多巴胺受体突触对多巴胺的再吸收，增加多巴胺的储存，临床上用于巴金森氏及其综合症，其分子结构见图1，其中含有1个手性中心，有(D)，(L)2种光学异构体。大量药效学研究结果表明其右旋异构体有药效，而左旋异构体无效^［1］。英国药典1998年版收载用HPLC法使盐酸司来吉兰手性分离，检查左旋体的含量，控制药品的质量^［2］。高效毛细管电泳法(HPCE)与高效液相色谱法(HPLC)相比较，柱效高，消耗低，成功应用于药物手性分离已有报道^［3，4］，但用HPCE法对D-L盐酸司来吉兰进行手性分离的研究尚未见报道，本文通过加入HP-β-CD手性选择剂使其光学异构体得到完全分离。

图1　盐酸司来吉兰的分子结构

1　仪器与试剂

　　仪器：Beckman P/ACE 5500型全自动毛细管电泳仪配备二极管阵列检测器和Gold软件数据工作站。中性毛细管柱50 μm×56 cm(有效长度49 cm)。
　　试药：磷酸氢二钾、磷酸、氢氧化钾均为分析纯；重蒸馏水；α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(Sigma试剂)；D-L盐酸司来吉兰(光学纯)，法国赛诺菲公司提供。盐酸司来吉兰片(批号6651197，6760298，6850689)赛诺菲民生制药公司。
　　对照品溶液的配制：称取D-L盐酸司来吉兰约8 mg，用水溶解并稀释至浓度为0.4 mg^.L^-1(1)和0.02 mg^.L^-1(2)。
　　磷酸盐缓冲液的配制：精密称取磷酸氢二钾17.4 g至100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，浓度为100 mmol^.L^-1磷酸氢二钾溶液，备用。

2　实验条件

　　工作电压：30 kV，检测波长：200 nm，柱温：15 ℃，阳极气压进样3 s，每日毛细管依次用0.1 mol^.L^-1盐酸溶液冲洗2 min，水冲洗2 min和运行缓冲液冲洗5 min，每次进样前均用水和运行缓冲液各冲洗2 min。

3　结果

　　取D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(2)在上述实验条件下，以HP-β-CD浓度为20 mmol^.L^-1的50 mmol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH 4.7)为运行液，进行电泳，记录电泳图；另称取盐酸司来吉兰片细粉适量，用水溶解并过滤，滤液稀释至浓度为2 mg^.L^-1的溶液，在上述实验条件下电泳，记录电泳图，见图2，按外标法以峰面积计算，结果3批盐酸司来吉兰片中L-盐酸司来吉兰含量均小于0.5%。

图2　盐酸司来吉兰片的电泳图
1. L-盐酸司来吉兰　2. D-盐酸司来吉兰

4　讨论

4.1　手性选择剂类型和浓度对对映体分离的影响
　　取α-CD、β-CD和HP-β-CD适量，分别制成浓度为20 mmol^.L^-1的50 mmol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH 4.7)，用D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)在上述实验条件下分别以上述缓冲液为运行液，进行电泳，结果见图3。以HP-β-CD为手性选择剂，使D-L盐酸司来吉兰得到完全分离(D：14.7 min，L：15.2 min)；以β-CD为手性选择剂，仅得到部分分离(D：9.3 min，L：9.4 min)；以α-CD为手性选择剂，仅出单峰(D-L：9.7 min)，其对映体不能分离，说明在上述实验条件下，HP-β-CD比α-CD和β-CD具有更好的手性识别能力，HP-β-CD的空腔与D-L盐酸司来吉兰相匹配，所以选择HP-β-CD为D-L盐酸司来吉兰分离的手性选择剂。

图3　D-L盐酸司来吉兰的电泳图
A. α-CD　B. β-CD　C. HP-β-CD
1. L-盐酸司来吉兰　2.　D-盐酸司来吉兰

　　用HP-β-CD浓度分别为2，10，20，30，40，50 mmol^.L^-1的50 mmol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH调至4.7)作为运行液，在上述实验条件下，取D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)进样，当HP-β-CD的浓度为2 mmol^.L^-1时，其对映体不能分离，仅出单峰，当浓度为10 mmol^.L^-1时，仅部分分离，浓度为20～50 mmol^.L^-1均能达到基线分离，但浓度为50 mmol^.L^-1时，分离最佳。当HP-β-CD浓度增加时，D-L盐酸司来吉兰的迁移时间增加趋势见图4。当HP-β-CD浓度为20 mmol^.L^-1时，迁移时间较短，D-L盐酸司来吉兰对映体分离较好。

图4　HP-β-CD浓度与D-L盐酸司来吉兰
迁移时间的关系
1. L-盐酸司来吉兰　2.　D-盐酸司来吉兰

4.2　运行液的酸度对对映体分离的影响　配制HP-β-CD浓度为20 mmol^.L^-1，滴加磷酸使pH分别为3.5，4.0，4.5，4.7，5.0，5.3的50 mmol^.L^-1磷酸盐缓冲液作为运行液，用D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)进样，按上述实验条件试验，当运行液的pH值改变时，D-L盐酸司来吉兰峰的迁移时间情况见图5。当pH为3.5时，呈单峰，当pH为4.0时，对映体仅部分分离，当pH为4.5～5.0时迁移时间呈平台，pH为4.7时，迁移时间最短，对映体得到最佳分离，选择为最佳运行液酸度。

图5　运行液pH与D-L盐酸司来吉兰
迁移时间的关系
1. L-盐酸司来吉兰　2.　D-盐酸司来吉兰

4.3　运行电压和柱温对D-L盐酸司来吉兰对映体分离的影响
　　用20 mmol^.L^-1 HP-β-CD的50 mmol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH为4.7)作运行液，当工作电压从30 kV减少至10 kV时，电流从30 μA减少至10 μA，D-L盐酸司来吉兰峰迁移时间延长，峰也展宽，对映体分离度变差，选择最佳工作电压为30 kV。
　　当柱温从15 ℃增加至40 ℃时，运行电流从28 μA增加至48 μA，D-L盐酸司来吉兰峰迁移时间缩短，因焦耳热背景噪音增加，对映体分离度差，所以选择15 ℃为最佳柱温。
4.4　检测波长对分析的影响　盐酸司来吉兰在215 nm处有最大吸收，在200 nm处有极大末端吸收，但运行缓冲液无吸收，当用200 nm作检测波长时，峰响应值较215 nm处增加约1倍，使浓度为0.02 mg^.mL^-1的盐酸司来吉兰溶液的峰响应大于噪音的20倍左右，提高了最低定量限。故将盐酸司来吉兰的检测波长定为200 nm。

黄宗玉（浙江省药品检验所　杭州　310004）
金瓯（浙江省药品检验所　杭州　310004）
韩加怡（浙江省药品检验所　杭州　310004）

参考文献

1，Martindale.The Extra Pharmacopoeia.U.K.Royal Pharmaceutical Society,1996.1167
2，BP.1998.1153
3，程庆春，李景仁，王洪.高效毛细管电泳法研究合成山茛菪碱的手性分离.药物分析杂志，1998，18(3)：149
4，沅宗琴，康经武，欧庆瑜.毛细管电泳环糊精添加剂与特布他林对映体的主体选择性研究.色谱，1998，16(6)：481

(本文于1999年4月27日收到)