六种酚类高效液相色谱分析法实施细则

　　酚类化合物是造成环境污染的工业化学品，天然有机物氯化或水消毒剂也能产生卤代酚副产物。酚有毒，它可使水带有讨厌的气味，味道和颜色。由于酚类对环境的危害性。我国饮用水卫生标准规定挥发性酚浓度〈 0.002mg/L，美国EPA要求分析十一种酚。
方法依据：美国EPA 604和建设部饮用水标准分析方法――酚类高效液相分析法(研编中)。 
应用范围: 本方法适用于饮用水、地下水和地表水等中的挥发酚的测定。 
干扰及消除：溶剂、试剂、玻璃器皿及所使用的仪器不洁将污染样品，使色谱图出现污染峰或使基线升高。通过对溶剂、试剂的滤膜过滤，重蒸馏纯化，清洗玻璃器皿消除污染峰，同时采用各个酚的特征波长来达到消除干扰和最佳检测条件。 
基本原理：本方法水样前处理用固相萃取法，用固相小柱吸附水中酚类，然后用溶剂将其洗脱下来，经纯氮吹气浓缩至一定体积后，用反相HPLC分析。在反相色谱柱上以甲醇/水+醋酸为流动相把经预处理的酚分离成单个酚，用紫外检测器（或二极管阵列检测器），测定各酚的峰高或峰面积，以外标法进行定量。 
仪器： 
高效液相色谱仪： 美国Waters 公司 
AutoTrace SPE 仪： 美国Zymark 公司。 
Turbovap LV 样品浓缩仪： 美国Zymark 公司。 
色谱检测器： 486可编程紫外分光检测器。 
色谱柱： 美国SUPECOSILTM LC－PAH柱 150χ4.6㎜ 。 
富集小柱： Porapak Rox 柱（Waters提供）或其他类似小柱。 
采样瓶：1升棕色玻璃细口瓶。 
6. 试剂：
甲醇：HPLC级，0.2μ滤膜过滤，脱气。 
高纯水：美国Barnstead纯水器生产，现用现制。 
四氢呋喃：HPLC级。 
正已烷： HPLC级。 
硫酸： 分析纯。 
冰醋酸： 分析纯。 
无水亚硫酸钠： 分析纯。 
酚类标准溶液： 苯酚、4-硝基酚、3-甲基酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚（国家标物中心或美国SUPLCO公司提供）。 
7. 测定步骤：
样品的富集：取水样500ml，加入硫酸调 1.5≤ PH ≤2，若样品有余氯，则加入约20mg无水 Na2SO3 脱氯。在AUTOTRACE工作盘上编制下列程序： 
Step1: Process 6 samples using the following procedure
Step2: Clean each sample path with 15ml into solvent waste
Step3: Clean each sample path with 30ml into aqueous waste
Step4: Dry column with gas for 1 minute
Step5: Pause and alter operator, resume when CONTINUE is pressed
Step6: Wash syringe with 5ml of DI water
Step7: Wash syringe with 5ml of MeOH
Step8: Condition column with 10ml of MeOH into solvent waste
Step9: Condition column with 10ml of DI water into aqueous waste
Step10: Load 500ml of sample onto column
Step11: Rinse column with 10 ml of DI water into aqueous waste
Step12: Dry column with gas for 0.5 minutes
Step13: Soak and collect 2ml fraction using THF
Step14: Pause for 3 minutes
Step15: Collect 2ml fraction into sample tube using THF
Step16: END
并调节参数：Cond Flow: 15.0 ml/min
Load Flow: 10.0 ml/min
Rinse Flow: 20.0 ml/min
Elute Flow: 5.0 ml/min
运行上述程序，用4ml THF收集，供HPLC分析用。
HPLC 分析： 
色谱条件：流动相：A-甲醇/1%(v/v)醋酸；B-纯水/1%(v/v)醋酸 
流速：1.0ml/min
柱温：室温
梯度：根据具体仪器分离情况确定
2.0min A：B=30：70 1.0ml/min
10.0min A：B=60：40 1.0ml/min
16.0min A：B=100：0 1.0ml/min
进样量：50μl
检测波长：
酚类苯酚4-硝基酚3-甲基酚二氯酚三氯酚五氯酚
波长（nm）275275275295295295

　
7.2.2 标准曲线：
标准用液的浓度：(参考)
酚类苯酚4-硝基酚3-甲基酚二氯酚三氯酚五氯酚
浓度(mg/L)10.05.110.09.69.710.1

标准曲线的制作：(参考)
进样体积组 份（ng）
(μl)苯酚4-硝基酚3-甲基酚二氯酚三氯酚五氯酚
55025.5504848.550.5
10100511009697101
20200102200192194202
40400204400384388404

　
以峰高或峰面积为纵座标，浓度为横座标绘制标准曲线，用外标法定量分析。
8. 定量分析：
8.1 色谱峰的测量：可测量峰高或峰面积，根据标准曲线计算定量。
8.2 由化学工作站根据校准曲线定量计算。
8.3 计算公式：
由于标准液与被测样浓缩液进样体积相同。
被测样浓度按下式计算
Cx(μg/L) = A x Hx x Vt / Vi x Vs
A = 标准浓度 x 进样体积/标样峰高（μg/mm）
Hx 样品峰高（mm）
Vt 样品浓缩体积（μl）
Vi 样品进样体积（μl）
Vs 水样体积（L）
9. 方法检测限、精密度、准确度：
9.1 方法检测限：
500ml水样富集到4ml THF 中，进样量为50μl 的检测限：
名 称苯酚4-硝基酚3-甲基酚二氯酚三氯酚五氯酚
检测限（μg/L)3.201.202.003.203.203.20

9.2 精密度
9.3 准确度
10. 质控：按总则5，水质检测质量控制进行。
11. 安全：使用的溶剂和流动相甲醇有毒，正己烷、四氢呋喃易燃，均为挥发性溶剂，溶剂蒸馏必须遵照有关安全规定，工作场所要有良好的通风条件，严禁明火。分析的酚类为有毒物质，因此，要有保护措施。