高效液相色谱法监测环孢素A的全血浓度

【摘要】  目的：建立高效液相色谱法测定环孢素A全血浓度的方法。方法：采用Spherisorb C 8(150 mm×4.6 mm，5 μm)分析柱，流动相为甲醇∶水(75∶25，V/V)，检测波长214 nm，流速1 ml/min，柱温为60 ℃。结果：环孢素A浓度在50 ng/ml～2 000 ng/ml范围内线性良好(r=0.999 8)，平均方法回收率为99.7%，日内及日间精密度＜6% (n=5)。结论：本方法简便、准确、可靠，能较好的满足临床血药浓度监测的需要。

【关键词】  环孢素A；高效液相色谱法；血药浓度监测

　　Hplc Determination of Cyclosporin A in Whole Blood

　　Abstract:Objective To establish a HPLC method for the determination of cyclosporin A in whole blood.Methods The Spherisorb C 8 column(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used,the mobile phase was methanolwater(75:25, V/V),the detection wavelength was at 214 nm,the flow rate was 1 ml/min and column temperature was 60 ℃.Results The linear range of cyclosporin A was 50 ng/ml～2 000 ng/ml(r=0.999 8). The average recovery was 99.7%(n=5). Withinday and betweenday variation coefficients were less than 6%.Conclusion The method is simple, accurate，and reliable.It is suitable for therapeutic drug monitoring.

　　Key words:Cyclosporin A；HPLC；Therapeutic durg monitoring

　　环孢素A(Cyclosporin A,CsA)是一种强效的免疫抑制剂，目前广泛应用于器官移植术后的抗排异反应。环孢素A治疗窗窄，个体差异大，用药时间长，保持适宜的血药浓度至关重要。CsA的血药浓度过高易引起肝、肾及中枢神经系统损害和感染；过低则发生排斥反应和诱发自身免疫性疾病，其肾毒性反应与肾移植术后发生的排异反应难以区别［1］。因此为提高CsA用药的安全性和有效性，必须在其治疗过程中定期监测血药浓度，并调整给药剂量［2］。我们用高效液相色谱法对器官移植患者术后CsA的全血浓度进行监测，并参考文献，对全血处理方法进行了研究和改进，使其能较好地满足临床的需要。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂  美国Waters系列高效液相色谱仪（包括1525二元泵、2487紫外检测器、柱温箱、Breeze色谱工作站）；FA2004型电子天平(上海天平仪器厂)；L128B型试管氮吹浓缩仪、L119型试管恒温加热仪(北京来亨科贸有限责任公司技术开发中心) ；YKHⅡ型液体快速混合器(江西医疗器械厂) ；LG102.4A型离心机(北京医用离心机厂) 。CsA标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号：130495200202，含量98.8％；CsD对照品由华北制药集团提供，含量99.5％；甲醇为色谱纯、钨酸钠、乙醚、正己烷均为分析纯。CsA贮备液：精密称取CsA标准品20 mg，加甲醇溶解并定容至100 ml，得200 μg/ml的 CsA储备液。CsA标准液:精密量取CsA贮备液5 ml，分别用甲醇稀释至50 ml和200 ml，得20 μg/ml和5 μg/ml的CsA标准液。内标工作液：精密称取CsD 36 mg，加甲醇溶解并定容至100 ml，从中精密量取10 ml，加甲醇稀释至100 ml，得36 μg/ml的内标工作液。上述溶液均置4 ℃冰箱保存。

　　1.2  色谱条件  色谱柱为Spherisorb C8柱(150 mm×4.6 mm，5 μm),大连依利特分析仪器有限公司提供；流动相为甲醇∶水(75∶25，V/V)；流速1 ml/min；检测波长214 nm；柱温60 ℃；灵敏度:0.100 0AUFS。

　　1.3  血样处理方法  取全血0.5 ml，精密加入内标工作液10 μl，涡旋30 s；加0.1 mol/L NaOH溶液（内含2%钨酸钠）1 ml，涡旋30 s；加重蒸乙醚5 ml，涡旋提取2 min，4 000 r/min离心10 min；分离乙醚层，于40 ℃试管恒温加热仪上氮气吹干，残渣加甲醇-10 mmol/L盐酸（3:1）溶液80 μl溶解，涡旋30 s；加正己烷300 μl, 涡旋30 s，3 000 r/min离心10 min，取下清液10 μl进样。

　　2  结果

　　2.1  色谱行为  在上述色谱条件下，色谱分离情况见图2，CsA、CsD保留时间分别为9.0 min 和10.8 min。可见CsA和CsD色谱峰分离完全，峰形良好，全血中内源性物质不干扰CsA的测定。

　　图1  空白血样（略）

　　图2  样品血样  1 CsA  2 CsD（略）

　　2.2  线性关系及检测限  取空白全血0.5 ml，分别加入内标工作液10 μl及CsA标准液适量，使CsA浓度分别为50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ ml、400 ng/ ml、800 ng/ ml、1 200 ng/ml、1 600 ng/ml、2 000 ng/ml，按“1.3”项下方法处理后进样，以CsA与内标峰面积比(X)对CsA血药浓度(Y)作回归分析，得回归方程Y=664.2X-28.1（r=0.9998，n=8），表明CsA全血浓度在50 ng/ml～2 000 ng/ml范围内线性关系良好。以信噪比S/N≥3计算, CsA最低检测浓度为15 ng/ml。

　2.3  精密度  配制CsA浓度分别为100 ng/ml、400 ng/ml、1 200 ng/ml的标准血样，按“1.3”项下方法处理后进样，进行日内、日间精密度测定，结果见表1。

　　表1  精密度结果（略）

　　2.4  回收率  分别以全血配制100 ng/ml、400 ng/ml、1 200 ng/ml 3个浓度，每一浓度制备5份，测定其回收率，结果见表2。

　　表2  回收率结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  测定方法  目前国内外测定全血中CsA的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、荧光偏振免疫法(FPIA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、放射免疫法(RIA)等。虽然FPIA法检测快速、灵敏、准确，但其使用的试剂盒价格昂贵，测定成本高，尤其在样本数少的情况下易造成较大的浪费。而HPLC法分离效果好，特异性强，其测定结果不受代谢物的影响，与药理效应之间具有良好的量效关系，测定成本也相对低廉［3］。

　　3.2  全血样品的处理方法  因CsA 41%~57%存在于红细胞中，一般先加碱使红细胞破裂游离出其中的CsA，再用有机溶剂萃取。萃取方法分单步和多步萃取法，也有采用SPE固相萃取柱萃取的方法［4］。多步萃取法国内外报道最多，单步萃取法和固相萃取法研究和应用相对较少，但经过优化实验条件后，单步萃取法较其他两种方法具有操作简便、省时、实验成本低的优点。

　　3.3  处理过程  本方法直接利用强碱去除大部分内源性杂质，再经正己烷进一步除去脂溶性干扰物后进样，简化了操作。全血碱化后用乙醚提取时发现易产生乳化现象，经调整了水相和有机相的比例（减少碱的用量）并在NaOH溶液中加入2%钨酸钠后，乳化现象基本消除［5］。乙醚重蒸后可以消除其中过氧化物对色谱图产生的干扰［6］。在用正己烷脱脂前先以流动相溶解残渣时出现混浊，且进样后色谱图中有杂峰干扰，而用甲醇溶解后有更多的干扰峰，最后选择以接近流动相的甲醇10 mmol/L盐酸（3:1）溶液完全溶解残渣，再经正己烷脱脂后进样，结果取得较好效果［7］。

　　3.4  流动相采用甲醇∶水(75∶25，V/V)，简单经济，毒性小；使用C 8柱，柱温控制在60 ℃，可实现样品峰与内标峰分离良好，有利于延长色谱柱的寿命，降低测定成本。本方法操作简便，测定结果准确，提取回收率>70%，检测限、线性及精密度等均符合临床血药浓度监测的要求。

　　3.5  我院临床药学室自2002年起在肝、肾移植术后患者中，用HPLC法监测CsA血药浓度已达4 000余例，目前以监测CsA峰浓度(C 2)为主。因为C 2在预测、判断是否发生排斥反应、尤其是有无肝肾毒性方面明显优于CsA谷浓度（CO），系统、连续地监测CsA血药浓度对临床工作具有重要意义。随着移植肾存活时间的延长，CsA治疗浓度水平逐渐下降，C0从术后的400 ng/ml左右降至两年后的150 ng/ml左右，C 2从术后的1 000 ng/ml以上降至2年后的600 ng/ml左右。CsA个体差异大，体内过程的影响因素很多，除了定期进行血药浓度监测，临床应用时还应根据肝肾功能、特殊检测及其他实验室检查结果，结合患者的实际情况作综合分析，及时调整治疗方案，实现个体化给药，从而提高CsA用药的有效性和安全性。

【参考文献】
  　　［1］ Morr S,Stacey M.Resuscitation in pregnancy［J］.BMJ,2003,327:12771279.

　　［2］ 王莉,杨宇如,卢一平,等.环孢素A血药浓度监测的临床意义［J］.现代泌尿外科杂志,2000,5(02):8997.

　　［3］ 陈锦珊,杜青云.全血中环孢素A药物浓度监测方法评价及其临床意义［J］.中国医院药学杂志,2004,24(08):486487.

　　［4］ 李楚云,徐振文,谢展雄.高效液相色谱法固相萃取测定全血环孢素A浓度［J］.中国医院药学杂志,2003,23(05):281283.

　　［5］ 李海菊,杨娟,王峰,等.RPHPLC 测定全血中环孢素A［J］.中国药学杂志,2005,40(11):857859.

　　［6］ 丁俊杰,李中东,焦正,等.人全血中环孢素A浓度的HPLC测定及药物动力学研究［J］.中国医药工业杂志,2004,35(02):9193.

　　［7］ 道毅俊,仲珑瑾,李中东,等.环孢素A胶囊人体生物利用度及生物等效性研究［J］.中国医药工业杂志,2006,37(11):749751.