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【摘要】目的测定广西产美味猕猴桃根中熊果酸的含量。方法以熊果酸含量为考查指标，采用正交实验优选提取工艺。采用高效液相色谱法，色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；柱温20℃；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液（85∶15）；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm。结果熊果酸的浓度在0.012 5～0.150 0 mg/ml时与峰面积呈良好的线性关系，样品的平均回收率为99.35％，RSD为1.52％（n＝6）。结论该方法准确可靠，重复性好，适用于美味猕猴桃根药材的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱 广西产美味猕猴桃根 熊果酸
Abstract:ObjectiveTo determine the ursolic acid in the roots of Actinidia deliciosa in Guangxi province by HPLC. MethodsWith the content of ursolic acid as index, orthogonal experiments were used to optimize extraction technology. HPLC method was developed. The separation was performed on Hypersil BDS C18 column (5 μm, 4.6 mm×250 mm). The column temperature was 20℃. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid (85∶15). The flow rate was 1.0 ml/min. The detection wavelength was 210 nm.ResultsThe result showed that there was good linear relationship between the area and concentration of ursolic acid within the range of 0.012 5～0.150 0 mg/ml. The average recovery was 99.35％ and RSD was 1.52％(n=6).ConclusionThe method is convenient, sensitive and reliable. It can be used for quality control of Actinidia deliciosa.
Key words:HPLC； Roots of Actinidia deliciosa in Guangxi； Ursolic acid
美味猕猴桃Acitinidia deliciosa为猕猴桃科猕猴桃属植物。性寒味酸、甘，有小毒，具有清热、利尿、活血、消肿的功效，适用于治疗肝炎、水肿、跌打损伤、风湿关节痛、淋浊、带下、疮疖等症［1］。现代研究表明，美味猕猴桃根提取物具有抗肿瘤和保肝作用［2～5］。本课题组曾对广西产美味猕猴桃根的化学成分进行研究，从抗肿瘤活性部位分离得到6个三萜类化合物。通过查阅文献，五环三萜类化合物广泛分布于植物界，显示出多种生物活性。它们的结构相似，且都具有抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭，并有诱导细胞凋亡的作用，对肿瘤细胞表现出较强的细胞毒活性。因此，三萜类化合物是潜在的癌症化学预防产物。但许多癌的化学预防药、癌的分化诱导剂、血管生成抑制剂均因毒性大而限制了其在临床上的应用，而熊果酸的毒性小，抗肿瘤活性广，包括抗突变、抗癌、抗氧化、抗血管生成和诱导癌细胞分化等作用，目前也是癌症研究领域的一个热点［6～9］。我们在美味猕猴桃根抗肿瘤活性部位中分离得到了熊果酸，通过文献查阅，迄今为止尚未见用高效液相色谱法测定美味猕猴桃根中的熊果酸含量的报道。因此我们采用高效液相色谱法对熊果酸含量进行测定，为美味猕猴桃根内在质量控制提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪(美国)：含在线真空脱气机器（G-1322A），高压四元泵（G-1311A），标准自动进样器（G-1313A），智能化柱温箱（G-1316A），可变波长检测器（G-1313A），二极管阵列检测器，Agilent1100 series色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；CG-16W高速微量离心机（北京医用离心机厂）；SB3200T超声波清洗仪（上海能信超声有限公司）；Millipore Simplicity-185超纯水仪（美国密里博公司）；BP211D电子天平分析天平（德国赛多利斯）。
1.2 药材与试剂美味猕猴桃根采于广西桂林（雁山植物园）及桂林地区（资源县、兴安县、全州县、龙胜县），经中国科学院广西植物研究所植物分类室鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物美味猕猴桃Actinidia deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson。标本存于广西中医学院药物分析教研室。熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号200212，供含量测定用），甲醇为色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司），乙腈为色谱纯（天津市四友生物医学技术有限公司），水为超纯水，其它所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；柱温为20℃；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液（85∶15）；流速为1.0 ml/min；检测波长为210 nm；进样量为10 μl；理论塔板数（以熊果酸计算）不低于6 000。
2.2 熊果酸提取方法的考察
2.2.1 提取溶剂的考察分别比较了20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和无水乙醇对美味猕猴桃根熊果酸的提取效果。精密称取美味猕猴桃根粗粉（过24目筛）5份，每份约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入上述不同的溶剂各20ml，称定重量，超声处理40min，放冷，称定重量，分别加入上述不同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进行含量测定。结果20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和无水乙醇提取熊果酸的含量分别为0.259，0.358，0.851，1.486，0.983 mg/g。实验结果表明80％乙醇提取熊果酸的提取率最高。
2.2.2 提取方法的考察比较了水浴回流提取、超声提取和冷浸3种提取方法对美味猕猴桃根熊果酸的提取效果，精密称取美味猕猴桃根粗粉（过24目筛）3份，每份约1.0g，分别加入70％乙醇20ml，采用以上3种提取方法分别提取1h，取续滤液，进行含量测定。结果回流提取、超声提取和冷浸提取熊果酸的含量分别为0.953，1.278，0.294 mg/g。结果表明超声提取对熊果酸的提取率最高。
2.2.3 正交实验采用正交实验法优化提取方法，考察了提取溶剂（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C）和提取次数（D）对提取结果的影响，各因素取3水平，进行L9（34）正交实验，正交设计表及分析结果见表1～3。
表1 正交实验因素水平（略）
表2 正交实验L9（34）结果（略）
表3 方差分析（略）
由实验结果的直观分析及方差分析可知，影响熊果酸提取效果的因素大小顺序为A＞C＞B＞D，即提取溶剂＞提取时间＞溶剂用量＞提取次数，而且各影响因素对实验结果有显著性影响。直观分析确定最佳提取方法为A2B3C3D2：即以25倍量的80％乙醇超声提取2次，40 min/次。
2.3 熊果酸的含量测定
2.3.1 对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品6.25 mg，置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，混匀，得0.25 mg/ml的熊果酸对照溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备采用正交实验所得的最佳方法进行提取，取药材粗粉（过24目筛）约1 g，精密称定，精密加入80％乙醇25 ml，称定重量，超声处理2次，40 min/次，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，合并两次滤液，离心，取上清液，即得。
2.3.3 方法学考察
线性关系考察：分别吸取上述熊果酸对照品溶液（0.25 mg/ml）0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 ml置1 ml容量瓶中，分别加入甲醇至刻度，分别取上述5个不同浓度的标准溶液10 μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定其峰面积。以对照品标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标，其色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，并求出回归方程式为Y=4 111.967 09X－2.473 213 3，r=0.999 6。结果表明，熊果酸对照品的浓度在0.012 5～0.150 0 mg/ml 时与峰面积呈良好的线性关系。
精密度实验：精密吸取熊果酸对照品溶液（0.05 mg/ml）10 μl，连续进样6次，进行分析测定熊果酸峰面积值，熊果酸平均峰面积为190.53，RSD为0.51%（n=6）。
重复性实验：取同一批供试品6份，每份约1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，进样10 μl，依法测定其含量，熊果酸的平均含量为1.507 mg/g，RSD为0.72％（n=6）。结果表明重复性良好。
稳定性实验：取同一份供试品溶液，在相同色谱条件下分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样10 μl，采用HPLC测定熊果酸的峰面积。在24 h内熊果酸的平均峰面积为149.99，RSD为0.86％（n=7）。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
加样回收实验：取同一批供试品6份，每份约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入0.25 mg/ml熊果酸对照品溶液3 ml，按上述供试品溶液的制备方法制备，进样10 μl，依法测定，计算回收率。结果见表4。
表4 熊果酸加样回收率测定结果（略）
结果表明，平均回收率为99.35％，RSD为1.52％，该方法可靠，准确度高。
药材中熊果酸的含量测定：分别称取5批不同产地美味猕猴桃根药材粗粉，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10 μl，进样，记录色谱图，以外标一点法计算各样品中熊果酸的百分含量。结果见表5。样品、对照品及空白溶剂的色谱图见图1～3。
表5 不同产地美味猕猴桃根中熊果酸的含量（略）
图1 美味猕猴桃根药材HPLC图（略）
图2 熊果酸对照品的HPLC图（略）
图3 甲醇空白的HPLC图（略）
3 讨论
以熊果酸的含量作为考察指标，筛选并确定最佳的提取方式，实验选择了超声提取方式。目前，超声技术被广泛应用于中草药有效成分的提取，超声波产生强烈振动、空化效应、搅拌作用等，可以加速药物有效成分进入溶剂，从而提高提取效率，缩短提取时间，并且避免了高温对提取成分的影响。超声提取与回流提取、索氏提取方式比较，提取时间短，提取效率高。
以熊果酸的含量作为考察指标，筛选并确定最佳的提取方法，首先考察了20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和无水乙醇对其含量的影响，实验结果表明80％乙醇提取熊果酸的提取率最高。
取熊果酸对照品溶液，在190～400 nm进行光谱扫描，其最大吸收波长为194 nm，但溶剂甲醇在短波长处均有吸收，为了减少干扰，又尽量不降低灵敏度，选择210 nm作为检测波长。
根据实际情况和熊果酸的有关含量测定的文献报道［10］，采用不同的流动相系统进行实验。本实验中考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸和甲醇-磷酸洗脱系统，结果选定乙腈-0.1％磷酸水溶液（85∶15）作为熊果酸含量测定的流动相。结果表明均能达到基线分离，柱效高，峰形好，能够完全满足色谱定量的要求。
采用正交实验法优化提取方法，考察了提取溶剂、溶剂用量、提取时间和提取次数对提取结果的影响，实验结果表明熊果酸的最佳提取方法是以25倍量的80％乙醇超声提取2次，40 min/次。
熊果酸的浓度在0.012 5～0.150 0 mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 6；平均回收率为99.35%，RSD为1.52%。
采用HPLC法，以外标法测定熊果酸的含量，方法简便、快速，准确度好，精密度高，可用于美味猕猴桃根药材熊果酸的质量控制。
【参考文献】
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