反相高效液相色谱法测定苦丁茶含片中槲皮素和山柰素的含量

　　【摘要】 目的建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定苦丁茶含片中槲皮素和山柰素的含量。方法以NovaPak C18(3.9 mm×300 mm，4.0 μm)为色谱柱；甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）为流动相；检测波长360 nm；流速0.7 ml·min-1；柱温40℃。结果槲皮素的进样量在0.012 99～0.649 6 μg范围内，山柰素的进样量在0.013 34～0.667 2 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率分别为97.03%和97.34%，RSD分别为1.16%(n=6)及1.42% (n=6)。结论该方法简便、快速、准确，可作为苦丁茶含片中槲皮素和山柰素的含量测定方法。

　　【关键词】  苦丁茶含片； 高效液相色谱法； 槲皮素和山柰素

　　Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for determination of the content of quertetin and kaempferol in Kudindcha tablets. MethodsThe Nova－Pak C18 column (3.9 mm×300 mm,4.0μm) was used.The mobile phase was methanol-0.4%H3PO4（50∶50），the detection wavelength was 360nm，the flow rate was 0.7 ml·min-1，the temperature was 40℃. ResultsThe linear range of quertetin was 0.012 99～0.649 6 μg , the linear range of kaempferol was 0.013 34～0.667 2 μg.The average recovery was 97.03%and 97.34%,RSD was 1.16% (n=6) and 1.42% (n=6). ConclusionThis method is simple，rapid and accurate. It can be used for determination of the content of quertetin and kaempferol in Kudindcha tablets.

　　Key words：Kudindcha tablets；  RP-HPLC；  Quertetin and Kaempferol

　　冬青属苦丁茶是我国南部及西南部民间传统的天然药用植物，具有清热解毒、生津、提神、益智、抗衰老、调血压、降脂等作用［1，2］。有文献报道［3，4］苦丁茶中含有丰富的黄酮类化合物，熊果酸及多种皂苷，其中有些黄酮苷元（槲皮素、山柰素、异鼠李素等）含量与银杏叶相当［4］。为了对广西苦丁茶进行开发利用，同时为了方便和满足临床的需求，我们拟研制开发新制剂——苦丁茶含片。本文采用高效液相色谱法测定了苦丁茶含片中槲皮素和山柰素的含量，以期为苦丁茶含片质量控制提供参考。

　　1  仪器与试药

　　Aters液相色谱仪（Waters600泵，7725i六通阀，996二极管阵列检测器，Millennium32数据处理系统）。槲皮素和山柰素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：0081－9304，0861－200002），甲醇（色谱纯）；磷酸(分析纯)，水为重蒸水。苦丁茶含片（本院自制）。

　　2  方法及结果

　　2.1  色谱条件 色谱柱为Nova－Pak C18柱 (3.9 mm×300 mm，4.0 μm)；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；检测波长360 nm；流速0.7 ml·min-1；柱温40℃。

　　图1  高效液相色谱图（略）

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取槲皮素对照品8.12 mg和山柰素对照品8.34 mg，分别置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.162 4 mg·ml-1的槲皮素对照液和浓度为0.166 8 mg·ml-1的山柰素对照液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备  取苦丁茶含片20片，精密称定（平均片重为0.5108 g），研细，精密称取细粉约2.0 g置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精取续滤液10 ml，置100 ml锥形瓶中，加甲醇10 ml，25%盐酸溶液5 ml，置水浴中加热回流0.5 h，取出后迅速冷至室温，转移至50 ml量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.2.3  阴性溶液的制备  按处方制备不含苦丁茶浸膏的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

　　2.3  空白对照实验  分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性空白对照液，按上述色谱条件测定。结果见图1，表明空白无干扰。

　　2.4  线性关系考察  分别精密吸取“2.2.1”项下配制的槲皮素对照液和山柰素对照液各0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0 ml置同一25 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，测定槲皮素及山柰素的峰面积。以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，结果回归方程为：槲皮素Y＝5 392 003X-67 439(r＝0.999 9)，山柰素Y＝5 304 855X＋478(r＝0.999 9)。结果表明，槲皮素的进样量在0.012 99～0.649 6 μg范围内，山柰素的进样量在0.013 34～0.667 2 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.5  精密度实验  精密吸取上述混合对照品溶液(槲皮素12.992 μg·ml-1；山柰素13.344 μg·ml-1)10 μl，连续进样5次，结果槲皮素峰面积的RSD＝1.87%，山柰素峰面积的RSD＝1.62%（n＝5）。

　　2.6  稳定性实验新配制的样品溶液（批号061210），每隔1 h精密吸取10 μl进样测定1次，共测定6次，结果，槲皮素和山柰素的RSD分别为1.58%和2.42%，说明在5 h内样品溶液稳定性良好。

　　2.7  重复性实验  取同一批样品（批号061210）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定含量，结果RSD＝1.28%（n＝6），表明本方法的重复性良好。

　　2.8  加样回收率实验  精密称取6份已知含量的样品(批号：061210，槲皮素：17.26 μg/片；山柰素：20.75 μg/片)细粉，每份约2.0  g，精密加入浓度为16.24 μg·ml-1的槲皮素对照液4.0 ml，浓度为16.68 μg·ml-1的山奈素对照品溶液4.5 ml，依“2.2.2”供试品溶液制备项下“精密加入甲醇20 ml，”起操作，制备供试液，将所得的供试液以0.45 μm的微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液在上述色谱条件下进样20 μl，按样品含量测定方法测定，计算平均回收率，结果见表1～2。槲皮素的平均回收率为97.03％，RSD＝1.16%（n =6）。山柰素的平均回收率为97.34％，RSD＝1.42%（n =6）。

　　表1  槲皮素加样回收率实验（略）

　　2.9  样品含量测定  取不同批号样品按“2.2.2”项下方法制备供试液，在上述色谱条件下，分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液及供试品溶液各20 μl，进样，测定各自峰面积，按外标峰面积法计算苦丁茶含片中槲皮素及山柰素的含量。结果见表3。

　　3  讨论

　　本实验仿照《中国药典》里银杏叶片中总黄酮醇苷的测定方法［5］，对苦丁茶含片中的槲皮素和山柰素进行含量测定，能很好地避免苦丁茶含片中其他成分的干扰，被测组分与杂质分离良好。

　　表2  山柰素加样回收实验（略）

　　表3  样品中槲皮素、山柰素的含量（略）

　　表中数据为每片样品中含量

　　本方法操作简便，灵敏度高，结果准确，可作为该品种实际生产中质量控制的标准。

　　【参考文献】

　　［1］ 江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学出版社，1986：1 288.

　　［2］ 陈杖洲.苦丁茶开发利用前景广阔［J］.茶叶机械杂志，1997，（2）：11.

　　［3］ 欧阳明安，汪汉卿，苏军华，等.苦丁茶化学成分的结构研究［J］.天然产物研究及开发，1997，9（3）：19.

　　［4］ 郁建平，万晴娇，张迪清，等.贵州苦丁茶黄酮研究［J］.贵州科学，1998，16（4）：286.

　　［5］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：597.