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【摘要】 目的建立银芍颗粒中绿原酸的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定该药中绿原酸的含量,色谱条件：Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0 mm，5 μm)色谱柱, 乙腈－0.4%磷酸水溶液（9∶91）为流动相；流速：1.0 ml·min-1；检测波长327 nm。结果绿原酸浓度范围在0.0025～0.04 μg之间峰面积与浓度线性关系良好，r= 0.999 9，平均回收率99.6%, RSD=1.07%。结论该方法准确、可靠、专属性强,可用于银芍颗粒的质量控制。
【关键词】 银芍颗粒 绿原酸 高效液相色谱法
Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of the content of chlorogenic acid in Yinshao Granule by HPLC. MethodsThe content of chlorogenic acid in Yinshao Granule was determined by HPLC. The chromatographic conditions were Agilent ZOBAX SB-C18 (250 mm×3.0 mm，5 μm) as analytic column, acetonitrile-0.4%phosphoric acid(9∶91) as mobile phase, the flow rate was 1. 0 ml·min-1， and the detection wavelength was at 327 nm. ResultsThe linearity of chlorogenic acid was good in the range of 0.0025～0.04 μg, r= 0. 999 9. The average recovery was 99.6% , and RSD was 1.07%. ConclusionThe HPLC method is accurate, reliable, specific, and can be used for the quality control of Yinshao Granule .
Key words：Yinshao Granule； Chlorogenic acid； HPLC
银芍颗粒是由金银花、赤芍、大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等10味中药材，具有解热止痛、活血消肿的功效。临床用于治疗急、慢性化脓性骨髓炎、关节炎、脓肿疔痛等。方中金银花的主要成分为绿原酸,鉴于银芍颗粒尚未建立定量的质量标准。为了有效控制银芍颗粒的质量，建立了高效液相色谱法测定绿原酸的含量［1～3］。
1 仪器与试药
1.1 仪器
DIONEX-P680高效液相色谱仪；AT-201电子分析天平（d=0.01 mg，瑞士）；Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0 mm，5 μm)色谱柱。
1.2 试剂与药品
绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110753-200413） ；银芍颗粒(银芍颗粒由华中科技大学协和医院药剂科自制，批号20061105, 20061107,20061108，20061110，20061112) 。乙腈（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司），磷酸（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司），水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈－0.4%磷酸水溶液（9∶91）(V/V)；检测波长为327 nm；流速1. 0 ml·min-1；进样量10 μl；柱温为30℃；理论板数按绿原酸峰计算，应不低于5 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥的绿原酸对照品适量，置1 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升中含绿原酸2.5 μg的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取银芍颗粒适量，研细，取1. 5 g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，放置15 min，取续滤液，置棕色具塞锥形瓶中，即得。
2.2.3 阴性溶液的制备
按处方比例和工艺，制成不含金银花药材的阴性样品，按“供试品溶液的制备”制备方法，同法制成阴性对照溶液。
2. 3 阴性干扰实验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1～3）。结果表明，供试品色谱图中，在与对照品色谱峰相应的位置上有相同的色谱峰，主峰与其它色谱峰达到基线分离，阴性对照无干扰。
2.4 线性关系的考察
分别精密吸取绿原酸对照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，16.0μl ，依次注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的峰面积值为纵坐标，计算得线性回归方程为：Y = 5 386.137 7X + 3.2912,r=0.999 9。结果表明，绿原酸进样量在0.002 5～0.04 μg浓度范围内与吸收峰峰面积值呈良好的线性关系。
2.5 精密度考察
精密吸取对照品溶液10 μl，按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样5次，记录峰面积分别为162.180 1，161.954 2，163.042 1，162.874 4，160.980 8。RSD为0.51%，说明仪器性能良好。
2.6 稳定性实验
取同一供试品溶液按上述色谱条件，于0，3，6，9，12，24 h按上述色谱条件各进样1次，测定峰面积，分别为141.003 8，139.075 4，136.063 1，135.220 3，135.043 9， 132.222 2。结果RSD为2.30%，说明测定时间内供试品稳定。2.7 重现性实验 精密称取同一批号的银芍颗粒样品(批号20061105)共5份，按含量测定项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，结果5次绿原酸的含量为0.005 47%，0.005 52%，0.005 80%，0.005 37%，0.005 62%。RSD为2.94%，说明方法重现性良好。
2.8 加样回收率实验
取已知含量同一批号的银芍颗粒样品(批号20061105)，研细，精密称取6份，0.75 g/份，分别置量瓶中, 加入一定量的绿原酸对照品，按“供试品溶液的制备”项下的方法依法制备，按上述色谱条件依法测定。结果见表1。加样回收率为99.6%，RSD为1.07%。表明本法回收率良好,可用于银芍颗粒中绿原酸的含量测定。表1 加样回收率实验结果（略）
2.9 样品的测定
取5批银芍颗粒，依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录绿原酸峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。表2 5批银芍颗粒样品绿原酸含量测定结果（略）
3 讨论
银芍颗粒中金银花为君药，绿原酸为金银花中的主要活性成分,具有抑菌消炎的作用,本文建立了银芍颗粒中绿原酸的高效液相色谱测定法。该法简便、灵敏、重现性好，可作为银芍颗粒的质量控制指标。
绿原酸溶液性质不稳定,遇光易分解,需要避光保存。故在实验过程中对照品溶液以及供试品溶液的制备、提取和分析中应使用棕色量瓶,尽量避光操作。
通过使用不同的流动相进行测试，发现流动相中的pH值对分离效果影响较大，而本品使用本文中的流动相比例，分离效果最佳。
【参考文献】
［1］国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：152.
［2］奉延旗，王 清，刘 冰. HPLC法测定小儿清解颗粒中绿原酸的含量研究［J］.中医药导报，2007,13(3)：71.
［3］魏英勤，刘晓辉，何 军.金银花提取物中绿原酸的HPLC测定［J］.山东轻工业学院学报，2006，20(4)：89.