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【摘要】 目的建立宁心红杞胶囊HPLC 指纹图谱分析方法。方法采用kromasil C18色谱柱, 乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,流速1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长205 nm。结果对10个批号的样品进行了测定，标出21个共有峰。结论 该法快速、准确、可靠，为宁心红杞胶囊生产质量控制和药物质量评价提供了依据。
【关键词】 宁心红杞胶囊；高效液相色谱；指纹图谱
Abstract：ObjectiveTo establish a method of fingerprint analysis of Menoprogen by HPLC. MethodsKromasil C18 column was used，with mixtures of 0.1% phosphoric acid and acetonitrile as mobile phase in a gradient elution. The flow rate was 1.0 ml/min，the column temperature was 30℃，detection wavelength was 205 nm.ResultsTen different samples were determined and 21 common peaks of chromatogram were detected . ConclusionThis method is quick,accurate,reliable and can be used for quality control of menopenry.
Key words：Menoprogen； HPLC； Fingerprint
中药复方的药效是来自于组成该复方的各种成分之间的协同作用，因此中药复方具有成分非常复杂的特点，现行的仅以其中的一种和/或两种化学成分的含量来作为评价中药质量的方法已越来越不合时宜。如何确保复方中药质量的稳定性和一致性已经成为大家关注的焦点。随着分析技术的发展，建立具有综合性、整体性特点的指纹图谱对中药复方制剂进行质量评价的方法已经成为可能并得到了普遍认同，我国食品药品监督管理局也于2000年要求将色谱指纹图谱作为中药注射剂的评价标准。宁心红杞胶囊是由枸杞子、熟地黄、桑椹、红花、山楂5味药组成，该制剂是一种治疗“围绝经期综合征”方剂［1］，不但具有组方简单的特点，而且临床疗效确切，但目前国内外还没有关于宁心红杞胶囊指纹图谱的研究，本研究在严格考察了实验方法的基础上建立了宁心红杞胶囊HPLC指纹图谱分析方法，为宁心红杞胶囊生产质量控制和药物质量评价提供了依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪( G1311AQuaternary Pump，G1379A Degasser，G1313A Autosampler，G1314A Variable Wavelength Detector)；HP ChemSation 工作站( 美国Agilent公司)；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)；Sartorius电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) 。
金丝桃苷(批号111521-200303，中国药品生物制品检定所)；宁心红杞胶囊样品由南京美福天然药物科技有限公司提供。
甲醇、乙腈(韩国SK chemicals 公司生产) 为色谱纯；磷酸（南京化学试剂有限公司生产）为分析纯；水为自制重蒸水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件Kromasil C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色谱柱，Phenomenex fusion-Rp C18(4.0 mm×3.0 mm)保护柱，柱温30℃，流速1 ml/min；检测波长205 nm，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，洗脱程序(见表1)。在选定条件下，金丝桃苷和相邻组分色谱峰分离度大于1.5，按金丝桃苷峰计算，理论塔板数在4 500以上，运行150 min，色谱图显示所有组分均在135 min内洗脱出柱。表1 流动相梯度变化程序（略）
2. 2 检测波长的选择本实验采用二极管阵列紫外检测器,在分析时进行全波长紫外扫描，并在不同波长下获取数据，经比较后表明205 nm色谱图出峰数目最多，峰形最好，基线平，各色谱峰相互之间分离度较好，故检测波长定为205 nm。
2. 3 溶液的制备
2. 3. 1 供试品溶液的制备精密称取宁心红杞胶囊内容物1 g，置10 ml容量瓶中，加甲醇适量，浸泡2 h，超声处理30 min，甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，进样前取续滤液用0.45 μm 微孔滤膜过滤。
2. 3. 2 对照物溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品10 mg置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度摇匀得0.1 mg/ml的溶液作为对照物溶液，进样前0.45 μm 微孔滤膜过滤。
2. 4 指纹图谱测定的方法学考察
2. 4.1 空白及对照实验 吸取甲醇10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。在选定条件下，空白溶剂(甲醇)对测定无干扰，见图1。
吸取参照物溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图2。
2. 4.2 精密度实验按“供试品溶液的制备”方法制备宁心红杞胶囊供试品溶液，连续进样5次，记录HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD在0.31%～1.42 %，相对保留时间的RSD在0.06%～0.16%，表明仪器精密度良好。
2. 4. 3 稳定性实验按“供试品溶液的制备”方法制备宁心红杞胶囊供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD在0.43%～1.87%，相对保留时间的RSD在0.13%～0.18%，表明样品在24 h内稳定性良好。
2. 4. 4 重复性实验取同一批样品按“供试品溶液的制备”方法平行操作，制备5份宁心红杞胶囊供试品溶液，记录HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD在0.29%～1.68%，相对保留时间的RSD在0.08%～0.15 %，表明方法重复性良好。
2. 5 宁心红杞胶囊指纹图谱的测定及技术参数
2.5.1 指纹图谱的测定吸取10个不同批号的宁心红杞胶囊供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下条件进行HPLC分析，记录135 min的色谱图。比较10批样品色谱图，发现21个峰是各批样品共有的，因此确定这21个峰为共有指纹峰，见图3。
2. 5. 2 对照物的选择在HPLC图谱中选择峰面积较大、出峰时间适中且稳定的色谱峰作为对照峰，其中保留时间为36.5min的色谱峰(7号峰)是HPLC 图谱中峰面积较大、出峰时间适中并且很稳定的一个峰，经标准品对照认定为金丝桃苷，故选择金丝桃苷作为对照物。表2 10 批宁心红杞胶囊的HPLC色谱指纹图中共有峰的相对保留时间（略）表3 10 批宁心红杞胶囊的HPLC色谱指纹图中共有峰的相对峰面积（略）
2. 5. 3 标准指纹图谱的技术参数及相似度计算在共有指纹峰中，7号峰(S峰)、20号峰的峰面积大于总峰面积的10%，3，6，10号峰的峰面积大于总峰面积的5%，参照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，只考虑3号峰、6号峰、7号峰、10号峰及20号峰的峰面积比值，其余各共有峰均按其相对保留时间定性。
标准指纹图谱的技术参数：以金丝桃苷色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积；以21个共有峰峰面积的均值做模板，利用“相关系数”法和“夹角余弦”法［2］计算指纹图谱的相似度，结果见表2和表3，2种方法计算的相似度结果均在0.99以上。
3 讨论
3.1 检测波长的选择实验过程中运用PAD检测器对各色谱峰进行了200～400 nm 扫描,并根据宁心红杞胶囊中各化学成分的紫外吸收波形选择205，254，270，360 nm波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在205 nm下，各峰分离良好，共有峰较多且峰形较好，因此选定205 nm为指纹图谱测定波长。
3.2 柱温的选择
同一条件下考察柱温（25，30，35℃）对各峰的影响，结果柱温为30℃时峰形更好，故将柱温定为30℃。
3.3 流动相的选择
主要考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等多种流动相系统的色谱分离情况，结果表明，0.1%磷酸-乙腈流动相系统的色谱图基线不漂移且分离度良好，故选择0.1%磷酸-乙腈组成流动相进行梯度洗脱。比较了0.1%磷酸-乙腈系统不同梯度变化程序的色谱图分离情况，结果表明，表1中程序分离情况较好，最终选定为指纹图谱测定梯度洗脱程序。
3.4 提取方法考察
比较发现超声与回流两种提取方法供试品溶液色谱图基本一致，从操作方便等方面考虑，选择超声处理为提取方法。
本实验在严格考察实验方法的基础上，建立了宁心红杞胶囊的RP-HPLC分析方法，通过对10个不同批次宁心红杞胶囊的分析，确定了21个共有峰，利用“相关系数”法和“夹角余弦”法计算这10个色谱图的相似度，结果均在0.99以上，上述结果表明所建立的宁心红杞胶囊指纹图谱具有代表性，其技术指标可靠，稳定，重现性好。
【参考文献】
［1］韦熔澄，徐昌芬，马 红，等.宁心红杞胶囊对围绝经期综合征的治疗作用［J］.药学进展，2004，28（11）521.
［2 ］苗爱东,孙殿甲. Excel 2002 在中药指纹图谱相似度计算中的应用［J］.药学进展，2003，27(1) ：51.