明胶微球乙肝疫苗动物免疫效果研究

明胶微球乙肝疫苗动物免疫效果研究

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 疫苗学

作者：赵晶　王立新

单位：卫生部北京生物制品研究所

关键词：明胶微球；乙型肝炎疫苗；佐剂配方

　　【 摘要 】　目的　研究并优化微球乙型肝炎疫苗的配方，观察微球乙肝疫苗对温度的稳定性。 方法　用明胶包裹HBs制备微球，设计不同配方及不同粒径微球乙肝疫苗、冻干微球乙肝疫苗于不同温度放置一定时间，免疫动物观察免疫效果。 结果　微球疫苗HBs包裹率＞90%，微球疫苗的免疫效果受佐剂配方及制备程序等因素影响，＜10μm的微球(5.6μm)免疫效果明显优于＞10μm的微球(25.4μm)(P＜0.02)及铝佐剂组(P＜0.01)。接种动物后可维持高水平抗-HBs IgG抗体(220～280mIU/ml)12个月以上；含铝佐剂的微球疫苗免疫效果优于不含铝的微球疫苗(P＜0.05)；单纯明胶微球与HBs混合后免疫可增强抗-HBs反应，稍低于包裹HBs的微球组。冻干HBs微球对温度稳定性优于铝佐剂吸附HBs。结论　＜10μm的微球疫苗和含铝佐剂的微球疫苗可产生最佳的免疫效果；冻干微球疫苗可望解决铝佐剂吸附乙肝疫苗需要冷链的问题。

Immunogenicity of gelatin microspheres encapsulated

　　hepatitis B vaccine in animal trial

ZHAO Jing, WANG Lixin. National Vaccine & Serum Institute, Beijing, P.R.China

　　【 Abstract 】　Objective　To research and optimize the formulations of the microspheres encapsulated hepatitis B vaccine, and its stability to temperature. Methods　Hepatitis B vaccine (HBs) was encapsulated in microspheres prepared from gelatin. The test animal were grouped and injected respectively with different sized microspheres blended HBs in various formulations and lyophilized. The lyophilized microspheres encapsulated HBs were kept under different temperatures for six months for observation of their stability. Results　The encapsulation efficiency of the antigen was over 90%. The immunogenicity of the microspheres encapsulated HBs could be influenced by both the adjuvant formulations and the procedures of microspheres preparation. The small microspheres (＜10μm) were significantly more immunogenic than the large microspheres(＞10μm) (P＜0.02) and Al(OH)₃ adsorbed HBs (Al-HBs) (P＜0.01), and the high titers of anti-HBs were kept for over 12 months after injection. Microspheres encapsulated Al(OH)₃ and HBs could more effectively enhance anti-HBs response than microspheres encapsulated HBs(P＜0.05), and the mixture of microspheres encapsulated HBs and Al-HBs(P＜0.05). The formulation of plain microspheres plus HBs could more effectively enhance anti-HBs response than Al-HBs. Probably there was a positive correlation between the number of microspheres and anti-HBs level. The lyophilized gelatin microspheres encapsulated HBs was more stable to temperature than Al-HBs. Conclusions　The small microspheres(＜10μm) encapsulated HBs and microspheresencapsulated HBs and Al(OH)₃ can induce the strongest immune response. The formulation of the plain microsphere plus HBs had some advantages and deserved further research. The lyophilized microsphere encapsulated HBs is more stable to temperature compared to Al-HBs, and it is presumed that the microspheres encapsulated HB vaccine can be transported without cold chain.

　　【 Subject words 】　Gelatin microspheres; Hepatitis B vaccine; Formulations

　　生物降解型聚合物微球已被证明是有效的抗原呈递系统^〔1〕，可提高抗原的免疫原性，诱导并调节体液与细胞免疫，可以冻干，注射部位副反应轻微，聚酯类微球还有缓释作用可减少疫苗的接种次数^〔2-4〕，因此对满足日益增多的基因重组与亚单位疫苗和简化免疫程序的需要，对配合CVI(children′s vaccine initiative)方案的实施具有非常重要的意义。目前在国外，微粒呈递系统因其良好的研究与应用前景，在众多新型佐剂中倍受推崇并被广泛研究开发，而国内很少报道。

　　目前用于包裹疫苗的材料有多种，包括聚酯类、明胶、聚丙烯淀粉、壳聚糖等。明胶材料易得、无毒并具备上述佐剂的优点，为首选用于制备微球疫苗，我们曾初步探讨了微球的制备及其免疫效果^〔5〕。国外亦有用明胶微球包裹模式即抗原-人γ球蛋白(HGG)的报道，认为HGG明胶微球较不完全福氏佐剂(FIA)结合的HGG可更大量地诱导血清特异性IgG的产生^〔2〕，但均未对微球疫苗的配方选择作进一步探讨。在众多研究中有关微球疫苗对温度的稳定性观察未见报道。本文重点研究了微球疫苗各种配方的免疫效果并观察了微球疫苗对温度的稳定性。

　　表1　不同球径HBs明胶微球免疫动物的抗-HBs滴度

　　Table 1. Anti-HBs titers obtained by immunizing animals with gelatin microspheres encapsulated HBs in different particle size

Group	Mean size(μm)	n	Anti-HBs GMT(
			1(months)	3(months)	11(months)
HBs-M	5.6	4	110.8±12.8	280.0±38.6	242.4±32.7
HBs-M	25.4	6	60.6±21.2	164.7±33.3	145.9±17.3
Al-HBs	-	5	70.0±18.4	102.1±22.6	130.4±13.0

　　HBs-M：microsphere encapsulated HBs；Al-HBs；Al(OH)₃ adsorbed HBs

表2　铝佐剂与HBs明胶微球不同的组合免疫后抗-HBs滴度

　　Table 2. Influence of Al(OH)₃/HBs-microsphere formulations on anti-HBs titers

Group	Mean size(μm)	n	Anti-HBs GMT(
			1(months)	6(months)	12(months)
HBs-M	15.4	5	86.7±　8.8	216.2±23.3	218.2±15.5
Al-HBs-M	17.2	5	59.9±17.1	191.1±31.0	256.3±18.2
Al-HBs+HBs-M	15.4	4	67.6±15.5	133.8±15.6	134.5±24.2
Al-HBs	-	5	70.0±18.4	98.0±19.0	101.0±28.8

　　HBs-M: microsphere encapsulated HBs；Al-HBs-M: microsphere encapsulated HBs and Al(OH)₃；Al-HBs+HBs-M: Al-HBs plus HBs-M

材料和方法

　　材料：明胶由上海化学试剂采购供应站提供；HBs为除菌过滤后的血源乙肝疫苗半成品，浓度210μg/ml。由本所提供。

　　微球制备：参照文献〔5〕加以适当改进：于分散介质油相中加入适量司盘80(Span 80)改善微球形态并使微球平均得率由78%增至98%；增加油相体积可减小微球粒径，制得的微球于125或500倍显微镜下计数500个，用测微器观察其粒径分布，并按文献〔5〕测定HBs被包裹率。所得微球粒径范围在1～50μm(平均球径5.6μm～30.0μm)，包裹率在90%以上。制备程序中热水浴与超声波本身所致水/油(W/O)乳液温度升高对HBs免疫力有破坏作用，在超声乳化过程中使用冷水浴可大大缓解该破坏作用；降低明胶浓度可使抗原包裹率降低可能是低浓度明胶胶体流动性大，胶体网架结构稀疏，在交联剂固化前，部分抗原在乳化和洗涤过程中流失。

　　免疫原的配方：微球疫苗的免疫效果受微球粒径、联合佐剂、微球与疫苗的组合方式等因素影响，为此我们设计了以下免疫组别：(1)大、小两组不同粒径包裹HBs的微球(HBs-M)；(2)含铝佐剂的HBs微球(Al-HBs-M)、HBs微球与铝吸附HBs混合(HBs-M+Al-HBs)、HBs微球3组不同配方；(3)分别用不同量单纯明胶微球(Plain gelatin microsphere, PM)与HBs混合(HBs+PM)，并与HBs微球比较；(4)分别用不同的交联剂甲醛和戊二醛固化HBs明胶微球；(5)冻干HBs微球及与铝吸附HBs(Al-HBs)于不同温度放置6个月；同时设常规铝佐剂乙肝疫苗为对照。以上所有实验组为同步和部分同步进行。

　　动物免疫和检测：豚鼠和NIH小鼠，用剂量为12μg/剂的上述不同配方的免疫原(疫苗)，分别皮下和腹腔注射1次，于免前与免后采血，每月1次，持续9～12个月；用RIA法检测血清抗-HBs抗体滴度(mIU/ml值)。

　　安全试验：用18～20克小白鼠10只及300克左右豚鼠5只，小鼠腹腔注射HBs微球22.6mg(含HBs 12μg)/只，豚鼠皮下注射相同剂量HBs微球。于3、7及14d各观察1次，实验鼠应健存、体重增加、无全身异常反应，允许皮下有硬结。

　　结果

　　1.动物免疫抗体应答

　　(1)包裹HBs 1～10μm的微球(平均粒径5.6μm)产生的抗-HBs水平明显高于10～50μm微球(平均球径25.4μm)(P＜0.02，P＜0.001)及铝佐剂组(P＜0.01，P＜0.001)，并保持1年左右(见表1)。

　　(2)Al-HBs微球(粒径范围5～25μm，平均粒径17.2μm)与HBs微球(粒径范围5～20μm，平均粒径15.4μm)相比，免后初期二者抗体水平相近(P＞0.10，第1个月P＜0.05)，7个月后前者高于后者(P＜0.05)，说明微球中加入铝佐剂可使HBs延迟释放且具有佐剂增强效应；Al-HBs与HBs微球(5～20μm，15.4μm)混合免疫并未出现联合佐剂的互补与协调作用，抗体水平明显低于Al-HBs微球组(P＜0.05，P＜0.005)和HBs微球组(P＜0.05，P＜0.01)，略高于铝佐剂组(P＞0.10，P＜0.05)，见表2。

　　表3　不同量单纯明胶微球与HBs混合后免疫动物的抗-HBs水平

　　Table 3. Anti-HBs titers obtained by immuizing animals with plain gelatin microspheres in different weights plus free HBs

Group	Dose of 　　Microsphere(mg)	Mean size(μm)	n	Anti-HBs GMT(
				1(months)	4(months)	12(months)
HBs-M	17.6	15.4	5	86.7±　8.8	215.4±　4.0	218.2±15.5
HBs+PM	22.6	15.8	5	72.0±19.0	223.4±36.4	236.1±34.4
HBs+PM	17.6	15.8	5	63.0±11.4	214.1±21.4	234.6±27.5
HBs+PM	4.2	15.8	5	62.5±29.0	132.3±34.5	147.7±21.6
Al-HBs	-	-	5	70.0±18.4	126.4±38.3	101.0±28.8

　　HBs+PM: plain gelatin microspheres plus HBs; HBs-M: microsphere encapsulated HBs 　　(3)经检测单纯明胶微球对HBs无吸附作用。将半成品疫苗稀释至每剂含HBs 12μg分别与不同量明胶微球(5～20μm，15.8μm)混合，每剂注射22.6mg和17.6mg微球产生的抗-HBs滴度无明显差异(P＞0.20)，高于每剂4.2mg微球组(P＜0.05，P＜0.01)及铝佐剂组(2个月以后P＜0.01， P＜0.005)；每剂22.6mg与17.6mg微球免后初期抗-HBs低于HBs微球组(P＜0.05)，4个月以后抗体水平升高则与后者无显著差异(P＞0.20)；每剂4.2mg微球产生的抗-HBs与铝佐剂组近似(见表3)。

　　(4)甲醛固化HBs微球免疫后抗体峰值早于戊二醛组(分别为3和5个月)，戊二醛固化HBs微球免疫抗体第1个月就达相当高的水平(112mIU)，之后缓慢升高，5个月后则超过前者，说明戊二醛交联作用强于甲醛。

　　(5)冻干HBs微球放置37℃ 6个月后免疫血清抗-HBs水平较对照组略有下降(P＞0.05)，但仍保持较高水平，室温组(15℃～25℃)抗体水平无下降(P＞0.20)；铝吸附HBs存放37℃ 6个月后抗体水平大幅下降(P＜0.01，P＜0.001)，室温组无下降(P＞0.20，见表4)。冻干HBs微球放置37℃、室温1、2年稳定性观察仍在进行中。

表4　冻干HBs微球与Al-HBs于37℃、室温(15℃～25℃)放置6个月后抗体免疫反应

　　Table 4. Anti-HBs response obtained by immunizing animals with lyophilized hBs-M and Al-HBs which had been kept under 37℃and room temperature 15℃-25℃ for six months

Group	Temperature	n	6 months Anti-HBs 　　GMT(
HBs-M	37℃	5	98.8±13.4
HBs-M	Room temperature	5	133.4±26.9
HBs-M control	-	5	143.3±27.7
Al-HBs	37℃	5	15.3±　3.8
Al-HBs	Room temperature	5	119.7±36.6
Al-HBs control	-	5	98.0±19.0

　　Mean size 30.0μm；HBs-M: microsphere encapsulated HBs　　2.安全试验：小鼠腹腔、豚鼠皮下注射后观察2周，无死亡，体重均增加，无全身异常反应。豚鼠注射部位可见3～5mm硬结，可能是尚未降解的微球，一般4～5个月后消失。

　　讨论

　　目前国外用聚合物包裹破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素、百日咳菌毛抗原、HBs、灭活流感病毒、HIV多肽抗原等制备微球，研究已取得很大进展，其中用聚酯微球包裹TT和HIV多肽抗原已进入临床初试。

　　已知微球佐剂的作用机理包括：(1)储库作用；(2)促进抗原靶向抗原呈递细胞(APCs)；(3)活化T及B细胞，促进信号传递和淋巴细胞的增殖活化；(4)诱导T及B细胞的免疫记忆^〔6〕。明胶对巨噬细胞(MΦ)有调理作用，小于10μm的明胶微球对抗原提呈细胞(APC) (主要是Mφ及树突状细胞DCs)具有很强的靶向性，可被APC快速吞噬，将高浓度的抗原投递到APC内，并呈递给T细胞，诱发强大的免疫反应；大于10μm的微球则表现储库作用，通过降解释放抗原。因此＜10μm的微球可诱发更强大的抗体免疫反应，并明显高于铝佐剂。

　　Al-HBs微球免疫效果优于HBs微球, 免后初期Al-HBs微球(平均粒径17.2μm)产生抗体并未高于HBs微球组(15.4μm), 可能是Al-HBs微球稍偏大, 微球被MΦ吞噬相对较少。若微球颗粒太大(50～100μm), 还可造成注射困难损失掉一部分, 导致免疫剂量不足, 抗体水平明显降低^〔5〕。

　　Singh^〔1，4〕认为将铝吸附TT和包裹TT的聚乳酸微粒混合(即铝佐剂-微粒联合)可更好地调动免疫系统，产生最高的抗体应答水平和保护效果。而将该混合配方用于HBs时，产生的抗-HBs水平与单一Al-HBs或聚乳酸包裹HBs微粒相同。我们将包裹HBs的明胶微球与Al-HBs混合后免疫动物，结果未表现出佐剂的协同作用, 产生的抗-HBs低于HBs微球组，其原因有待探讨。

　　单纯明胶微球对抗原无吸附作用, 与HBs混合后免疫, 抗原不能直接靶向APC, 故初始抗-HBs水平稍逊于HBs微球。说明明胶微球可活化APC对微球及细胞外环境抗原的吞噬作用。Nakaoka R^〔2〕认为明胶微球本身并无促有丝分裂性, 不能增强免疫反应, 除非将γ-HGG包裹入微球内并投递到效应细胞内, 增强免疫反应; 若微球释放抗原于细胞外环境则不能比溶液性抗原更有效地诱导免疫反应。然而我们的实验结果并不支持这一论点，可能是由于明胶微球本身具有对Mφ的调理作用, 也可能是两种抗原(HBs与γ-HGG)结构性质不同所致。O Hagan^〔7〕认为吸附卵元蛋白(ovalbumin OVA)的聚乳酸微球(1.0μm)可增强血清IgG反应, 稍低于微球包裹OVA组(1.5μm)。

　　根据WHO的推荐, 佐剂安全性包括组织抗原相容性、材料易生物降解、皮下或肌肉注射可安全释放及贮存期的稳定性。明胶微球作为一种免疫佐剂优于传统使用的铝佐剂, 明胶微球疫苗对温度的稳定性优于铝佐剂, 可以冻干, 安全无毒副作用, 明胶微球还可同时增强体液与细胞免疫反应, 并能产生加强注射的反应^〔2〕。因此有望成为人用疫苗的候选佐剂。

　　志谢：本研究得到王丽霞、张俊香的帮助及孔健、史德林老师的支持与指导, 在此特表感谢。

　　参考文献

　　1　Singh M, Li XM, Wang HY, et al. Immunogenicity and protection in small-animal models with controlled-release tetanus toxoid microparticles. Infection and Immunity, 1997, 65(5):1716-1721.

　　2　Nakaoka R, Yasuhiko TB, Yoshito IK. Potentiality of gelatin microsphere as immunological adjuvant. Vaccine, 1995, 13(7):653-661.

　　3　Eldridge JH, Staas JK, Meulbroek JA, et al. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system. Mol Immunol, 1991, 28:287-294.

　　4　Singh M, Li XM, McGee JP, et al. Controlled release microparticles as a single dose hepatitis B vaccine: evaluation of immunogenicity in mice. Vaccine, 1997, 15(5):475-481.

　　5　巩志立, 赵晶, 郑秋君, 等. 明胶微球乙型肝炎疫苗的研究. 中国生物制品学杂志, 1997, 10(3):165-168.

　　6　柳钟勋. 新型免疫佐剂在疫苗中的应用. 中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17(5):337-341.

　　7　O Hagan DT, Jeffery H, Davis SS. Long-term antibody responses in mice following subcutaneous immunization with ovalbumin entrapped in biodegradable microparticles. Vaccine, 1993, 11(9):965-969.

(收稿日期：1999-03-29)