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T细胞Trail受体表达及Trail诱导的T细胞凋亡
中国免疫学杂志 2000年第3期第16卷 分子细胞免疫学
作者：范学工
单位：范学工（湖南医科大学湘雅医院传染科，长沙410008）
关键词：Trail受体；淋巴细胞；细胞凋亡；流式细胞术
摘 要 目的：观察人T细胞Trail(TNF-related apoptosis-inducing ligand)受体表达及Trail诱导T细胞凋亡的作用。方法：通过荧光双标记，使用流式细胞仪检测Trail受体阳性细胞和凋亡细胞。结果：静息Jurkat细胞表达高水平Trail受体〔(49.19±12.25)%〕，激活Jurkat细胞对Trail受体表达无影响。Trail诱导显著的Jurkat细胞凋亡〔(90.01±26.71）%〕。正常人外周血淋巴细胞(PBL)仅激活后表达Trail受体〔(25.27±6.42)%〕，但无细胞凋亡发生。结论：人T细胞表达Trail受体，Trail受体和Trail的相互作用对细胞凋亡有调控作用。
中国图书分类号 R392.12
The expression of Trail receptor on human T cells and apoptosis induced by Trail
FAN Xue-Gong
（Department of Infectious Diseases,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008）
Abstract：Objective： To investigate the expression of Trail(TNF-related apoptosis-inducing ligand)receptor on human T cells and apoptosis induced by Trail.Methods: The positive cells for Trail receptor and apoptotic cells were determined by flow cytometry. Results:Trail receptor on unstimulated Jurkat cells was found in (49.19±12.25)% and the stimulation could not increase the expression of Trail receptor on Jurkat cells.The apparent apoptosis of Jurkat cells was found in (90.01±26.71)%. Peripheral blood lymphocytes(PBL)from healthy donors may express Trail receptor after activation (25.27±6.42)%,but no apoptosis was observed in these PBL.Conclusion: Human T cells may express Trail receptor.The ligation of Trail receptor and Trail plays an important role in regulation of apoptosis.
Key words：Trail receptor Lymphocytes Apoptosis Flow cytometry
细胞凋亡是生物体最重要的生理和病理现象之一，其在清除过量的激活的免疫细胞，维持免疫系统的内稳定方面起着极其重要的调节作用。在细胞凋亡的调控系统中，Fas/Fas配体在免疫细胞的表达和作用已被广泛研究和报道［1］。新近，另一个重要的凋亡调节蛋白Trail(TNF-related apoptosis-inducing ligand)或称Apo-2配体在免疫细胞的表达及其所诱导的细胞凋亡，引起了研究者们的极大兴趣和重视［2］。本文报道应用流式细胞术(Flow cytometry)检测T细胞Trail受体和Trail诱导T细胞凋亡的部分工作。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 重组人Trail(rhTrail) rhTrail由瑞士巴塞尔大学医学微生物学研究所Erb教授实验室制备，是一种谷胱甘肽S转化酶(GST)融合蛋白。
1.1.2 细胞株 Jurkat细胞系人CD4阳性T 细胞株，购自美国ATCC公司。
1.1.3 其他 Alexa标记的抗GST单克隆抗体(Alexa抗GST)和7氨基放线菌素(7-amino-actinomycin D,7aad)均购自分子探针(Molecular Probes)公司；抗CD3单克隆抗体(5 μg/ml，PharMingen)；植物血凝素(PHA，10 μg/ml)，刀豆蛋白A(ConA,5 μg/ml)，乙酸肉豆寇佛波醇(PMA，5 μg/ml)和离子霉素(ionomycin,1 μm)均购自Sigma公司。
1.2 原理
1.2.1 Trail受体测定 如果细胞表面有Trail受体表达，当rhTrail与细胞孵育时，就会结合细胞膜上的Trail受体。本研究中所用rhTrail系与GST的融合蛋白，故Alexa抗GST抗体又可结合到rhTrail的GST上。通过流式细胞仪测定Alexa阳性细胞，即可获得Trail受体阳性细胞。
1.2.2 细胞凋亡测定 7aad结合于凋亡细胞的细胞核，不同阶段的凋亡细胞，其7aad的结合率不同，凋亡晚期细胞比凋亡早期细胞结合更多7aad，故可区别不同阶段的凋亡细胞［3］。
1.3 方法 洗涤培养于RPMI1640的Jurkat细胞，并计数。根据不同的实验要求，Jurkat细胞于24孔培养板分别与PHA(3 d)，ConA(2 d)，PMA加离子霉素(P/I,4 h)或抗CD3抗体(1 d，抗CD3先包被培养板过夜)在培养箱中孵育。另一组仅Jurkat细胞加RPMI1640(非刺激组)。然后收集和洗涤细胞2次，按2×105细胞/管与rhTrail(1∶50)于培养箱中孵育24 h后，洗涤细胞2次，加Alexa抗GST抗体，于室温下避光孵育15 min，加入7aad(20 μg/ml)再育15 min，又洗涤细胞2次，用1%多聚甲醛固定后用流式细胞仪(Becton Dickinson)于FL-1测定Trail受体表达，FL-3测定细胞凋亡。
常规方法获得健康实验室工作人员外周血单个核细胞，按以上同样步骤测定Trail受体表达和细胞凋亡。
1.4 统计学处理 采用配对t检验和相关分析。
2 结果
2.1 Jurkat 细胞的Trail受体表达 静息Jurkat细胞能表达较高水平Trail受体(图1)，P/I、PHA、ConA和抗CD3抗体刺激Jurkat细胞后，并未上调节Trail受体的表达(表1)。
图1 Trail受体表达
Fig.1 The profile of flow cytometry for Trail receptor expression
Note:Open histogram represents control(Jurkat cells+Alexa anti-GST)and shaded histogram represents Trail receptor expression on Jurkat cells(Jurkat cells+rhTrail+Alexa anti-GST)
表1 Jurkat细胞的Trail受体表达(
Tab.1 The expression of Trail receptor on Jurkat cells(
The positive cells for Trail receptor(%)
Jurkat+anti-GST
4.22±1.05
Jurkat+rhTrail+anti-GST
49.19±12.251)
Jurkat+P/I+rhTrail+anti-GST
40.51±15.361)
Jurkat+PHA+rhTrail+anti-GST
45.26±16.381)
Jurkat+ConA+rhTrail+anti-GST
42.76±17.421)
Jurkat+anti-CD3+rhTrail+anti-GST
46.51±17.151)
Note:1)P＜0.001 compared with Jurkat+anti-GST,respectively;n=10 determinants;datas were not shown in the Tab. for groups Jurkat,Jurkat+GST,Jurkat+GST+anti-GST and Jurkat+stimulants+anti-GST because their values were similar to the group Jurkat+anti-GST2.2 Jurkat细胞凋亡 rhTrail(1∶50)可诱导显著的Jurkat细胞凋亡，即使1∶1 000稀释rhTrail，仍可诱导(41.21±11.56)%的细胞凋亡。预料之外的是，P/I刺激后，Jurkat细胞凋亡率较未刺激者下降，其涉及的机制尚不清楚(表2)。此外，由图2可知，使用7aad我们可以区分不同阶段的凋亡细胞。
表2 rhTrail诱导的Jurkat细胞凋亡(
Tab.2 Jurkat apoptosis induced by rhTrail(
Apoptotic Jurkats(%)
Jurkat+7aad
10.91±2.25
Jurkat+rhTrail+7aad
90.01±26.711)
Jurkat+P/I+rhTrail+7aad
61.96±16.181)
Jurkat+PHA+rhTrail+7aad
83.65±30.051)
Jurkat+ConA+rhTrail+7aad
91.30±28.211)
Jurkat+anti-CD3+rhTrail+7aad
78.43±22.361)
Note:1)P＜0.001 compared with Jurkat+7aad,respectively;n=10 determinants;data were not shown in the Tab. for groups Jurkat,Jurkat+GST,Jurkat+GST+7aad and Jurkat+stimulants+7aad because their values were similar to the group Jurkat+7aad
图2 细胞凋亡图
Fig.2 The profiles of flow cytometry for apoptosis
Note: A: dot plot for Jurkat+7aad;B: dot plot for Jurkat+rhTrail+7aad.Live cells became 3 groups:live cells,early apoptotic cells and late apoptotic cells;C: histogram for Jurkat+rhTrail+7aad.This histogram corresponds to the dot plot B.Cell peak 1,2 or 3 corresponds to cell group 1,2 and 3 respectively
2.3 Jurkat细胞Trail受体表达与其凋亡的相关性 Jurkat细胞的Trail受体阳性细胞值与Jurkat细胞凋亡值之间存在显著正相关(n=10,r=0.816，P＜0.005)。
2.4 外周血淋巴细胞(PBL)Trail受体的表达 与Jurkat细胞不同，静息的PBL不表达Trail受体，仅激活的PBL表达Trail受体，但其值明显低于Jurkat细胞(表3)。
表3 正常人PBL Trail受体表达和细胞凋亡(
Tab.3 Trail receptor expression on PBL and PBL apoptosis in healthy subjects ( Trail receptors(%) cells(%)
The positive cells for
Apoptotic
PBL+anti-GST/7aad
4.88±1.62
10.71±3.45
PBL+rhTrail+anti-GST/7aad
7.72±3.01
14.05±5.01
PBL+P/I+rhTrail+anti-GST/7aad
25.27±6.421)
15.11±4.67
PBL+PHA+rhTrail+anti-GST/7aad
19.35±4.551)
14.34±4.46
PBL+ConA+rhTrail+anti-GST/7aad
22.67±5.411)
15.20±5.27
Note:1)P＜0.005 compared with PBL+anti-GST/7aad,respectively;n=10 determinants;data were not shown in the Tab. for groups PBL,PBL+GST,PBL+GST+anti-GST/7aad and PBL+stimulants+anti-GST/7aad because their values were similar to the group PBL+anti-GST/7aad2.5 PBL凋亡 即使在激活的PBL，rhTrail也未能诱导凋亡(表3)。
3 讨论
Trail是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员中的一员，通过与Trail受体结合(ligation)，诱导靶细胞凋亡［2］。与Fas/Fas配体不同的是，Trail受体/Trail仅诱导肿瘤细胞、转化细胞或病毒感染细胞凋亡，而不引起正常细胞凋亡［2，4］。这一特点使其在肿瘤治疗中有着潜在的广泛应用前景。目前已证实，Trail表达于多种器官和组织，包括T、B淋巴细胞［5，6］。但对于Trail受体的表达情况，则报道甚少。
本研究表明，Jurkat细胞表达Trail受体，这种Trail受体的表达似与Jurkat细胞激活与否无关，并且，rhTrail与Jurkat细胞表面的Trail受体结合的同时，诱导了显著的Jurkat细胞凋亡，这提示Trail在某些疾病的细胞凋亡过程中有调节作用。由于目前尚无商品化的抗Trail单克隆抗体，故在本实验中暂无法通过抗Trail抗体阻断实验来进一步肯定Trail诱导的凋亡。但Trail受体表达与细胞凋亡值的高度正相关以及所设立的合理的对照组说明，本研究中的Jurkat细胞凋亡确系rhTrail诱导所致。与Jurkat细胞不同的是，正常人PBL须激活后方可表达Trail受体。更令人感兴趣的是尽管有Trail与Trail受体的结合，但正常人PBL却无细胞凋亡发生。已有报道，Trail可诱导人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的外周血T细胞凋亡［6］，但Trail能否诱导其他病毒感染者的T细胞凋亡目前尚不清楚。现在认为，存在4种Trail受体，其中2个受体为“诱骗”(decoy)受体，能与Trail结合，却不诱导靶细胞凋亡，起到保护靶细胞的作用［2］。这可能是为什么Trail不能诱导正常细胞凋亡的重要机制之一。是否本研究中正常人PBL表达的Trail受体为“诱骗”受体，值得进一步研究。
配体和受体相互作用将诱导细胞凋亡，这在下调节T细胞介导的细胞毒等免疫反应，从而减轻组织损伤方面起重要的调控作用［5，6］。然而，过度的T细胞凋亡将损害细胞免疫功能［1］。T细胞Trail受体/Trail的研究，对于阐明某些感染性疾病和自身免疫性疾病的发病机制有着重要的意义。
致谢：非常感谢Erb教授提供他的实验室以完成此项研究。
本文工作在瑞士巴塞尔大学医学微生物学研究所Erb教授实验室完成
作者简介：范学工，男，41岁，教授，博士生导师，主要
从事感染与免疫学研究株，购自美国ATCC公司。
参考文献：
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［6］Jeremias I,Herr I,Boehler T et al.Trail/apo-2-ligand-induced apoptosis in human T cells.Eur J Immunol,1998;28:143
收稿日期：1999-06-19