TRAIL及其受体与肝癌

【关键词】  肿瘤坏死因子；受体；肝癌

    TRAIL即肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体，属于肿瘤坏死因子超家族，1995年和1996年分别由Wiley［1］和Pitti［2］等分离并鉴定。它能够选择性地诱导瘤细胞凋亡，但不影响正常细胞的生长分化。和TNF家族其他成员不同的是，TRAIL在体内仅以膜结合型存在，体外实验表明，无论膜结合型的还是可溶型的TRAIL，都能迅速诱导表达TRAIL特异受体的细胞发生凋亡,使其在肿瘤治疗中作用成为热点。

    1  TRAIL及其受体的生物学特性

    1．1  TRAIL的结构和分布  1995年Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出与细胞凋亡配体l(Apo 1L)具有较高同源性的TNF超家族成员，命名为Apo 2L(Apoptosis2 Ligand)，即TNF相关性凋亡配体TRAIL。TRAIL基因定位于3q26．1～26．2，cDNA全长1．05 kb，编码281个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜蛋白，其中241个位于胞膜外区，功能部位为119～241位氨基酸残基。N末端14个氨基酸位于胞浆区，与TNF家族的其他成员无同源性，没有明显的信号肽。C末端位于细胞膜外，保守性较强，形成几个折叠结构，再形成典型的链夹心，即同源三聚体结构。TRAIL的细胞外部分降解后可形成可溶性TRAIL（sTRAIL）克隆。sTRAIL缺少跨膜区和胞内区，N末端无信号肽结构，可溶型分子N端氨基酸的缺失不影响其生物活性。

    TRAIL分子中有一些特殊的位点，如第109位的天冬氨酸是一个潜在的N糖基化位点，但邻近脯氨酸会阻碍其糖基化。95位到281位残基之问只有一个不配对的半胱氨酸(E230)，通过它螯合锌原子形成三聚体，分子中无二硫键形成，三聚体是最强的生物活性构型。C230是TRAIL重要的功能基团，当它突变时，则不能形成三聚体。TRAIL与其受体结合能力降低200倍，诱导靶细胞凋亡的能力下降，而且生物活性也会改变。从95位或104位残基开始构建可溶型分子TRAIL(sTRAIL)克隆［3］，表达出的蛋白均有活性，并能与特异的受体结合。非还原性SDsPAGE分析sTRAIL24×103，约在48×103处形成二聚体，三聚体大约为66×103。人TRAIL基因的转录本存在于多种组织，如胎肝、胎肺、胎肾以及成人脾、胸腺、前列腺、卵巢、小肠、结肠、外周血淋巴细胞、心脏、胎盘、骨骼肌、肾脏等。在突变的细胞如退行性淋巴系K299，扁桃体T细胞中含量也特别高，但脑、肝、睾丸中不转录此因子。多种刺激因子可诱导TRAIL表达，如丝裂原［刀豆球蛋白A(Con A)、佛波脂(PMA)、多聚胞苷酸(IC)、离子酶素等］；CD3McAb和细胞因子如IL及INF。此外还有炎症性的细胞毒素如葡萄球菌肠毒素，脂多糖等。

    1.2  TRAIL受体  目前已发现了两类TRAIL受体，一类为功能型受体，如TRAIL R1和TRAIL R2，因含有死亡结构域(death domain，DD)而分别被称为死亡受体4(death receptor 4，DR4)和死亡受体5(death receptor 5，DR 5)。TRAIL R1由468个氨基酸组成，其N端具有信号肽结构。胞外区含有两个半胱氨酸丰富的重复区，胞内区含有死亡结构域，这是一个由77个氨基酸组成的功能区，与TNFR1，DR3和FAS的死亡功能区具有较高的同源性［4］。TRAIL R1中死亡功能区的氨基酸序列相对保守。它在正常组织如脾、外周血白细胞、小肠、甲状腺、活化的T细胞等以及肿瘤组织中均有表达。 TRAIL R1可以选择性地结合TRAIL，同时有实验表明，过度表达的TRAIL R1能够不依赖相应配体而直接诱导细胞的凋亡。TRAIL R2含有411个氨基酸，为I型跨膜糖蛋白结构。与TRAIL R1相似，其N端为信号肽，胞外区也存在两个富含半胱氨酸的重复区，胞内为死亡结构域，与TRAIL R1有很高的同源性，它在MCF7细胞和Hela细胞中过度表达能诱导这些细胞凋亡。其诱导凋亡作用可以被caspase的抑制剂CrmA和2VADfmk抑制，提示它可能通过激活caspase家族引起凋亡［4～6］。

    DR3为一细胞因子受体，分布于富含淋巴细胞的组织和器官中，表现出诱导细胞凋亡和激活转录因子NFκB两种生物活性。另一类为无功能型受体，如TRAIL R3又称诱捕受体1(decoy receptor 1，DcR1)，TRAIL R4,又称诱捕受体2(decoy receptor 2，DcR2)。所有受体的胞外区结构高度同源，而无功能型受体胞内区缺失，因而丧失介导细胞凋亡的功能，更重要的是，无功能型受体仅高表达于正常细胞，而在癌细胞表面表达很低或不表达。因此TRAIL能诱导表达TRAIL特异受体的肿瘤细胞发生凋亡，而不损害正常组织细胞。TRAIL R3由259个氨基酸组成，其显著的结构特点是没有胞内区即不含有死亡功能区，而只有信号肽，含有两个半胱氨酸丰富的重复区的胞外区以及跨膜区。实验表明它与TRAIL的亲合力与TRAIL R1和TRAIL R2相近，可溶性的TRAIL R3能够抑制TRAIL诱导的凋亡，当其过度表达时则不能在体外诱导细胞的凋亡。该受体在人的正常组织分布广泛，常分布于心脏、肺、肝、肾、骨髓、脾、胎盘中，而多数癌细胞上则不存在该受体［5］。TRAIL R4由386个氨基酸组成，胞外功能区与其他3个TRAIL受体具有高度同源性，可达58％左右。其C末端的胞内仅含有死亡功能区的1／3，故与TRAIL结合之后不能介导凋亡。但有实验表明，它有抑制TRAIL R1和TRAIL R2介导的凋亡的作用。TRAIL R4在许多正常组织具有表达而在许多肿瘤组织中不表达［7,8］。

    护骨素(osteoprotegerin，OPG)是一种分泌型糖蛋白，是TNFR超家族的新成员［9］。在体内具有抑制破骨细胞发生、增加骨骼密度的作用。OPG结合位点与DR5重叠，但它与TRAIL的亲和力比DcR1和DR5弱得多。缺乏死亡结构域，不能传导死亡信号，与TRAIL结合后不能诱导肿瘤细胞凋亡。OPG能够抑制TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡，反过来，TRAIL也能阻断OPG抑制破骨细胞发生的作用。可见OPG和TRAIL是相互调节的。

    2  诱导凋亡的途径及其调控机制

    2.1  诱导凋亡的机制  TRAIL诱导凋亡主要通过DR介导。TRAIL首先以同源三聚体的形式作用于DR，引起DR中的DcR发生聚集并以之为中介结合接头分子（adaptor）,形成死亡诱导信号复合体（deathinducing signal complex,DISC）导致caspase8在局部募集和自身活化。活化的caspase8再以级联反应激活下游的caspase,引起细胞凋亡。

    2.2  诱导凋亡的调控  核转录因子（NFκB）激活能够阻止细胞凋亡，原因可能是在其转录水平上一组抑制凋亡的关键基因。研究表明，TRAIL只在其凋亡诱导通路被阻断时才激活NFκB,对TRAIL诱导凋亡耐受的细胞，原因可能是由于TRAIL作用的信号通路被NFκB的激活所代替。通过激活或抑制NFκB的活性可以调节细胞对TRAIL的敏感性，但是NFκB对TRAIL的调节作用比较复杂，可能具有双向调节作用，这取决于NFκB的两种亚单位的表达水平［10］。

    3  TRAIL及其受体在肝癌发生中的作用

    有研究［11］发现肝癌和癌旁均有DR4、DR5的表达，而DcR1、DcR2在癌旁肝组织和正常肝组织中虽也都有表达，但在肝癌中有明显表达差异。二者在肝癌和癌旁肝组织的阳性表达率分别为67.86%和100%,78.57%和100%。应用 RTPCR和免疫组织化学方法，证实死亡受体DR4、DR5在肝癌和癌旁组织中广泛存在，其蛋白产物主要存在于细胞的胞浆;在诱捕受体DcR1、DcR2的表达检测中，确实发现多例肝癌组织不表达，免疫组化结果也可观察到明显的分界。实验表明诱捕受体并不是仅仅表达于正常和癌旁肝组织，在肝细胞肝癌中，诱捕受体也有较高的表达(DcR1 42.31 %,DcR2 53.85%)。与DcR2相比，DcR1的表达偏低，PCR产物电泳的灰度值和免疫组化的阳性结果明显较弱。对于肝组织来说，两种受体所起的保护作用中［12］，DcR2可能更大。这些表达差异为TRAIL 作用的选择性提供了依据。有研究发现［13］，PHC组织中TRAIL之癌旁组织中的低水平表达，表明PHC发生过程中通过TRAIL途径所诱导的细胞凋亡不足，可能与肿瘤的发生及发展有一定的相关，四种受体在PHC及癌旁组织中均有表达，定量分析显示其表达存在差异，PHC组织中DR4、DR5的表达明显高于DcR1及DcR2，且高于癌旁组织中DR4、DR5的表达。PHC组织中死亡受体的高表达，可能是机体主动抗肿瘤的一种自卫机制，这为TRAIL用于抗PHC治疗提供了依据。DR的表达与肿瘤的分化、肿瘤分级有关,低分化的肿瘤DR 表达减少(P＜0.05) , Ⅲ/ Ⅳ期肿瘤DR 的表达量显著低于Ⅰ/ Ⅱ期肿瘤( P＜  0.01) ,表明肝癌细胞可通过DR 表达量的减少来逃避TRAIL 诱导的凋亡。但与病人的性别、年龄、AFP水平、肿瘤的大小以及是否转移无关［14，15］。TRAIL 在不同分化程度的癌组织中表达有差异,中、低分化癌中的表达明显低于高分化癌的表达。这表明TRAIL 可能是肿瘤分化差的标志,肿瘤在其进展过程中存在某种免疫逃逸机制,通过下调TRAIL 的表达而逃避其诱导的凋亡。

    4  TRAIL及其受体的抗肝癌作用

    TRAIL诱导的凋亡不依赖p53的状态，因而不同于放疗和化疗诱导凋亡的的机制，TRAIL不仅单独应用具有抗肿瘤活性，而且与多种药物之间具有协同作用,化疗药物胆酸［16］,COX2 抑制剂以及干扰素β［17］，NS398、CAY10404［18］。细胞因子白介素2、细胞诱导分化剂等均能增加肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，与其他抗肿瘤药物的联合应用不仅减少了药物单独应用时的副作用，而且增加了疗效，具有良好的应用前景。就肝癌细胞来说，多种药物对TRAIL介导的细胞凋亡有增强作用，如以curcumin［19］预处理肝癌细胞系，通过上调DR5的表达及下调SVV的表达来增强TRAIL介导的对肝癌细胞的凋亡作用。Kim等［20］研究发现，化疗药物Sulforaphane以及胆酸能诱导DR4和DR5的表达，与TRAIL联合应用对TRAIL敏感和TRAIL抵抗的细胞都具有诱导凋亡的作用。

    5  结语

    由于TRAIL及其受体在肿瘤治疗中的作用特点，使其具有广阔的应用前景，但是在应用于临床前必须进一步证实其安全性。此外，如何延长其半衰期以维持其靶细胞或靶组织中的有效治疗浓度也是今后要解决的问题，而将含有TRAIL基因的病毒载体导入肿瘤细胞中，使其持续表达功能性TRAIL蛋白将是一种很有发展前途的肿瘤治疗途径。

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作者单位：滨州医学院组织学与胚胎学教研室 滨州市 256603