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关键词 大肠肿瘤 转移 nm23-H1 免疫组化 图像分析
Expression of nm23-H1in colorectal neoplasms
and correlation with tumor metastasis
Yang Yun，Wang Zhen，Wang Fang，et al.
Department of Pathology，Kunming Medical College，Kunming650031.
【Abstract】 Objective To study the function of nm23-H1gene in colorectal carcinogenesis and to investiˉgate its correlation with tumor metastasis.Methodsnm23-H1was detected at its protein levels by immunohistocheˉmistry（IHC）and image analysis（IA）technique in normal colorectal mucosae，colorectal adenomas，colorectal carciˉnomas with no regional lymph nodes metastasis，colorectal carcinomas with regional lymph nodes metastasis and their corresponding regional lymph nodes metastatic sites.Results There was no significant differences of nm23-H1proˉtein expressions in colorectal carcinogenesis.However，most of the carcinoms with regional lymph nodes metastasis showed reduced nm23-H1expression，as compared to the carcinomas with no regional lymph nodes metastasis，and the correlation was negative（P<0.01，r s =0.456）.There was no obvious difference betweenthe expressions of nm23-H1in the primary sites of colorectal carcinomas and those in the corresponding regional lymph nodes metstatic sites，nor was there apparent difference in sex，age，histological type and tumor invasion.Conclusion nm23-H1can inhibit colorectal carcinoma metastasis.Additionally，the facts that there were no isgnificant differences of the expresˉsions of nm23-H1proteins in colorectal carcinogenesis indicated that nm23-H1gene can not distinguish between normal colorectal tissues and colorectal neoplasms，nor can it distinguish between benign colorectal neoplasms and maˉlignant colorectal neoplasms.
Key words colorectal neoplasms metastasis nm23-H1 immunohistochemistry image analysis
大肠癌的早期转移是患者术后复发和死亡的主要原因，但对于转移的确切机制迄今未明。近年，国内外学者对于肿瘤转移抑制基因nm23-H1（non-metastatic23rd gene）与肿瘤转移关系的研究较多，争议也较多。本文采用免疫组化、计算机图像分析等技术，观察人正常大肠粘膜、大肠腺瘤、无淋巴结转移的大肠癌、有淋巴结转移的大肠癌、淋巴结转移灶中nm23-H1蛋白的表达和定位特点，并探讨其与大肠癌淋巴结转移的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 组织标本选自昆明医学院病理学教研室、昆明医学院附属第三医院外科手术切除标本、大肠粘膜 活检组织和尸体解剖中临床资料完整的存档蜡块，共80例。其中，正常大肠粘膜15例，大肠腺瘤12例，无淋巴结转移的大肠癌24例，有淋巴结转移的大肠癌15例，淋巴结转移灶14例。大肠肿瘤的诊断标准按2000年WHO肠道肿瘤组织学分型进行。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。
1.1.2 病例资料 39例大肠癌标本，男26例，女13例;年龄30～79岁，平均年龄（55.5±11.1）岁;组织学分级:高分化腺癌13例，中分化腺癌22例，低分化腺癌4例。所有患者术前均未行放疗和化疗。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化 采用SP法（链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接法）。鼠抗nm23-H1单克隆抗体、即用型SP试剂盒、液体DAB酶底物显色试剂盒均为美国Maxin公司产品，购自福州迈新生物技术有限公司。每次实验均以已知阳性组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，每例均设有HE切片作对照观察。免疫组化结果判断标准:nm23-H1蛋白的阳性信号定位于细胞浆和/或细胞膜，为黄～棕黄色颗粒。请两位病理学专家双盲法观察切片，采用半定量积分法 ［1］ 判断结果。具体操作如下:（1）阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分;（2）阳性强度无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将（1）（2）两者积分相乘，0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++），若两位专家结果相差3分则重新判定。
1.2.2 应用计算机图像分析技术对免疫组化结果进行定量 应用本教研室提供的HPIAS-1000高清晰度病理图文分析系统，对免疫组化结果进行定量分析。以阳性单位（Positive Unit，PU） ［2］ 作为量化指标:PU= Gα-G A .（1-A A α）Gmax ×100Gα为阳性产物的灰度，GA为测试区域A范围内的平均灰度值，AAα为阳性产物在A测试区域中的面积密度，G max 为图像分析仪设定的最大灰度值。用PU来定量表达 免疫组化的阳性和阴性反应结果，以反映免疫组化染色强度。PU值越大，阳性反应强度越大;PU值越小，阳性反应强度越小。
1.2.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件包。计数资料用Nonparametric Tests中的Independent Samples…过程，计量资料用Compare Means中的One-Way ANOVA过程，并作参照单位分析图。
2 结果
2.1 正常大肠粘膜和大肠肿瘤组织中nm23-H1蛋白的表达及其与大肠癌淋巴结转移的关系nm23-H1蛋白免疫组化阴性对照为阴性;正常大肠粘膜中，阳性信号为黄～棕黄色粗颗粒，定位于细胞浆（图1）;大肠腺瘤组织中，阳性信号多为棕黄色颗粒，密集成团分布于细胞浆（图2）;大肠癌无淋巴结转移组，阳性信号为黄～棕黄色颗粒，散在成团定位于细胞浆（图3）;大肠癌有淋巴结转移组及淋巴结转移灶内，阳性信号多为黄色颗粒，散在分布于细胞浆（图4）。各组中nm23-H1蛋白免疫组化检测结果见表1，并以正常大肠粘膜为标准组，作各组中nm23-H1蛋白表达情况的参照单位分析图（图5）。nm23-H1蛋白表达与大肠癌淋巴结转移的关系见表2。（图1～4见封三）
表1 各组中nm23-H1蛋白表达的阳性率和表达强度（PU）的比较
表2 nm23-H1蛋白表达与大肠癌淋巴结转移的关系nm23-H1蛋白表达
2.2 nm23-H1蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系 nm23-H1蛋白表达与病人的性别、年龄、组织学分级间差异均无显著性（P>0.05），见表3。
3 讨论
nm23基因是1988年由Steeg等 ［3］ 用消减杂交法从7个转移潜能不同的K-1735黑色素瘤细胞系中首先发现和分离出来的。目前在人类中至少已鉴定出6种nm23基因的亚型。其中nm23-H1基因与癌转移的关系更为密切 ［4～6］ 。研究表明，nm23-H1基因定位于人染色体17q21.3，长约10kb，编码分子量为18.5kD的多肽NDPK（nucleoside
表3 nm23-H1蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系。nm23-H1基因可通过其产物NDPK影响细胞内信号传导系统，影响微管、微丝等细胞骨架蛋白的生物活动，从而抑制肿瘤细胞的转移。但许多学者在该基因与肿瘤转移的关系的进一步研究中，分歧较大。
我们在实验中发现，在正常大肠粘膜→大肠腺瘤→无淋巴结转移的大肠癌的发生发展过程中，nm23-H1蛋白的表达在各组间差异未见显著性，但在无淋巴结转移的大肠癌中呈增高表达的趋势，与Royds等 ［7］ 报道的结果相一致，提示nm23-H1蛋白的表达特点不能鉴别正常大肠组织与大肠肿瘤，也不能鉴别大肠肿瘤的良恶性，在大肠肿瘤的形成过程中，其作用也许有限或者至少