点击显示 收起
【摘要】 目的 检测贲门癌癌组织中nm23和p53基因外显子突变情况，寻找有助于准确预测局部肿瘤进展、分型、预后情况的临床参照指标。方法 应用PCR-SSCP检测21例贲门癌癌术后新鲜标本组织中nm23及p53基因外显子突变情，并与贲门癌癌的病理及临床指标进行相关性研究。结果 nm23表达及p53基因突变率分别为71.4%及48.86%。nm23和/或p53基因突变与临床分期呈正相关（P<0.01）。结论 nm23和/或p53基因突变与贲门癌癌临床分期相关。nm23基因表达及p53基因突变在判断贲门癌癌细胞增殖、分化程度、恶性进度及预后转归方面有一定价值，可作为判断贲门癌癌预后的参考指标，指导高危患者的进一步治疗。
关键词 nm23 p53 胃肿瘤
Expression of mutation and significance of tumor metastasis suppressor gene nm23and suppressor gene p53in cardiocarcinoma
Mao Weimin，Chen Wanyuan，Chen Xufeng，et al.
Zhejiang Hospital，Zhejiang310013.
【Abstract】 Objective Our study aimed to investigate whether nm23expression and p53gene mutation in the primary cardiocarcinoma correlated with tumor grade stage recurrence metastasis and patient survival time.Methods RT-PCR and PCR-SSCP is used to test the expression in nm23，test the mutation in p53of the samples.21cases paraffin embedded samples were admitted.Results The gene expression rate of nm23were71.4%and the gene mutation rate of p53were48.86%.All expression and mutation happened in the low grade tumor.In this study，nm23gene express and p53gene mutation was correlated with histological grade and clinical stage and closely correlated.Conclusion We found that nm23and p53play an important role in the development and progression of cardiocarcinoma.nm23and p53appear to be associated with the proliferation and progression of cardiocarcinoma.Both of them can be used as prognostic factors in cardiocarcinoma.
Key words nm23 p53 stomach cancer
nm23及p53分别为肿瘤转移抑制基因和肿瘤抑制基因 ［1，2］ 。肿瘤的发生是细胞内单基因或多基因发生改变决定的，抑癌的基因的失活和癌基因的激活是正常细胞转化为癌细胞的主要原因 ［3，4］ 。nm23基因、p53基因是目前发现分布最广与肿瘤相关性最高的癌相关基因，它们与贲门癌的相关性报道虽较少，结论不一，且多为单一因素分析。为寻找有助于准确地预测局部肿瘤的进展、分型及预后情况的临床对照指标，我们采用PCR-SSCP（polyˉmerase chain reaction-single stranded conformation polyˉmorphism）和RT-PCR技术检测了21例贲门癌癌术后石蜡包埋病理切片中的nm23及p53基因外显子 突变情况，并分析其与贲门癌癌发生、发展及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 标本选用浙江省肿瘤医院胸外科1993～1998年贲门癌部分切除、新鲜肿瘤标本21例，其中男16例，女5例，年龄38～78岁，平均60岁。按WHO分级标准:Ⅰ期3例，Ⅱ期2例，Ⅲ期16例。另取2例正常贲门癌粘膜组织蜡块作为对照。随访1～9年。
1.2 方法
1.2.1 提取DNA 取标本，将标本剪碎置于1.5 mlEP管中，离心弃上清，沉淀后依次加入100%、95%、70%乙醇漂洗。加入消化液和蛋白酶K混匀，50℃过夜;用蛋白沉淀液沉淀蛋白质，离心，将上清液转入新的EP管中，加入冷乙醇沉淀DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 PCR扩增 用已定量的DNA样本进行PCR扩增。所有试剂均采用nm23（RT-PCR用β-actin作为内对照）及p53突变检测试剂盒。PCR反应总体积为25μl。PCR扩增程度:p53:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次。
1.2.3 用SSCP检测 常规灌制8%聚丙烯酰胺凝胶，取p53扩增产物加入变性上样缓冲液，95℃变性10min，点样，120V电泳3h，硝酸银染色，nm23:PCR扩增程序同前，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。分析结果。
1.2.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 PCR扩增产物鉴定 以β-actin为DNA分子量标准参照，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，21例贲门癌癌标本nm23阳性为15例，提示其nm23基因表达。
2.2 p53用SSCP分析 在21例贲门癌癌病理标本中，在p53基因中第7、第8外显子分别存在泳动变位的例数是7例、3例，共10例，提示其p53基因存在突变。nm23阳性率为及p53基因突变率分别为71.4%及48.86%。见图1、2。图1显示nm23表达情况，N为正常带，T为肿瘤标本。图2中，3、4、5带显示DNA泳动变位，提示这3例标本p53第8外显子有碱基改变。
3 讨论
肿瘤转移是肿瘤患者主要死亡原因之一 ［5］ 。肿瘤的发生和转移是两个相互关联又各自独立的生物学过程，转移可受自身的转移基因及转移抑制基因的调控 ［6，7］ 。肿瘤转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞运动，浸润周围组织，穿透基底膜，逃逸免疫反应并在远离原发部位增殖，形成转移灶。寻找在转移过程中起作用的基因，可指导对转移性肿瘤的诊断和治疗策略。为阐明肿瘤发生、发展是一个多基因、多阶段的遗传学改变过程，我们用PCR-SSCP检测了21例贲门癌癌存档石蜡标本中nm23基因表达及p53基因突变情况。发现nm23在贲门癌组织中表达很高为71.4%;p53抑癌基因突变位点以第 7、8外显子为主，突变率为48.86%。nm23及p53基 因
突变主要发生在细胞分化不良及肿瘤已发生转移的贲门癌癌标本。本组21例标本中同时有nm23表达及p53突变的病例有5例，均为晚期病人，并于术后2年内死亡。本研究结果表明，nm23表达和/或p53突变与贲门癌癌临床分期呈正相关（P<0.01）。结合以上结果可以看出，有nm23和/或p53基因突变的肿瘤病例，其肿瘤转移早，生存年限低，预后差，提示nm23表达和/或p53基因突变在肿瘤形成、发展中是早期事件，对控制细胞的增殖、恶性细胞转化起作用。同时具有nm23表达和/或p53基因突变是贲门癌癌加速发展的信号，应引起临床重视，可做为判断贲门癌癌恶性程度及进展情况的有价值的参考指标。所以开展nm23表达合并p53基因突变检测有助于筛选肿瘤分级或T 2-3 患者中具有转移潜能的贲门癌肿瘤，用于更准确地评估病人预后及转归，同时可指导手术后的整体治疗方案。肿瘤的发生是多基因协同作用的结果，nm23、p53基因的突变可能通过增加基因变异事件的积累而起作用，并影响着肿瘤发展。因此，只有对多种癌基因、抑癌基因及其它相关因互进行综合研究才能将我们对肿瘤发生、发展过程的认识提高到一新阶段，本研究有助于贲门癌肿瘤在分子水平上进行解释，其结果展示了癌相关基因研究的临床应用前景，并为今后发展转基因治疗提供了线索。
参考文献
1 Sobel ME.Metastasis suppressor gene.J Natl Cancer Inst，1990，82:267.
2 Levine AJ.The p53tumor suppressor gene.Nature，1991，452:453.
3 Itahana K，Dimri GP，Hara E，et al.A role for p53in maintaining and esˉtablishing the quiescence growth arrest in human cells.J Biol Chem，2002，May17;277（20）:18206-18214.
4 Murdoch WJ，Van Kirk EA.Steroid hormonal regulation of proliferative，p53tumor suppressor，and apoptotic responese of sheep ovarian surface epithelial cells.Mol Cell Endocrinol，2002，Jan15;186（1）:61-67.
5 Sugarbaker EV，Weingard DN，Rosem an JM.Patterms of metastasis in hunman malignancies.Cancer boil Rev，1981，2:235.
6 Devita V T.Cancer principles and practice of oncology.Philadelphia:JB Lippincott Co，1989，98.
7 Yamaguchi A，Urano T，Goi T，et al.Expreeion of nm23-H1and nm23-H2protein in hepatoocellular carcinoma.Cancer，1994，73:2280.
作者单位:
1 310013浙江医院
2 310022浙江省肿瘤医院
（收稿日期：2004-06-06）（编辑晓 青）