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【摘要】 目的 观察神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）与去甲肾上腺素（NE）对心肌细胞生长、细胞内蛋白质合成的影响及二者的相互作用。 方法 进行原代乳鼠心肌细胞培养，以 3 H-亮氨酸掺入率的变化来反映NPY、NE对心肌细胞内蛋白质合成的影响。 结果 （1）NPY组、NE组 3 H-亮氨酸掺入率显著高于对照组（P<0.01）;（2）NPY与NE合用可使心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率进一步升高，与二者单独使用组相比差异有非常显著性（P<0.01）。 结论 （1）NPY、NE均可促进心肌细胞内蛋白质的合成;（2）NPY与NE在促进心肌细胞内蛋白质合成过程中有明显的协同效应。
【关键词】 神经肽Y;去甲肾上腺素;心肌细胞肥大
The hypertrophic effects of NPY and NE on cardiomyocytes
ZHOUYong，ZENG Chun-yu，Liu Guang-yao，et al.
The466th Hospital of PLA，Beijing100089，China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of NPY and NE on cellular hypertrophy in cardiomyocytes，and conclusions were wished be uesful theoretic guides for clinical therapy.Methods Neonatal Wistar rat's cardiomy-ocytes were cultured first，then the effects of NPY，NE on cardiomyocytes growth were observed by measuring the changes of the 3 H-Leucine incorporation ratio in different concentrations and different times.Results （1）The 3 H-Leucine incorporation ratios were significantly higher in NPY and NE group than in control（P<0.01）;（2）The 3 H-Leucine incorporation ratios of NPY+NE group were significantly higher than NPY and NE group（P<0.01）.Con-clusion （1）NPY and NE could induce the hypertrophy of cardiomyocytes;（2）Being factors which were co-secreted from sympathetic nerves，NPY and NE woked in coordination with each other in cardiomyocytes growth.
【Key words】 cardiomyocyte hypertrophy;neuropeptide Y;NE
神经肽Y（NPY）是1982年从猪脑中提取出来的一种含36个氨基酸的多肽，为非肾上腺非胆碱类神经分泌的递质，具有显著的心血管活性 ［1］ 。本实验采用培养的心肌细胞为模型，以NPY为直接刺激因素，排除了完整心脏研究中心肌继发性缺血和心脏内其它递质的影响，直接观察NPY对心肌细胞生长的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂 M199培养基（美国Hyclon公司），胰蛋白酶（华美生物工程公司），神经肽Y（美国Sigma公司），去甲肾上腺素（上海禾丰制药有限公司）， 3 H-亮氨酸（中国原子能研究所）:放射线浓度1mCi/ml，铅瓶4℃储存，临用前用去离子水配成所需浓度。液体闪烁液:称取PPO4g，POPOP0.4g，溶于1000ml AR级甲苯中，再加入570ml无水乙醇，充分混合。
1.2 乳鼠心肌细胞培养与鉴定 ［2］ 出生3天之内的Wistar乳鼠（由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供），培养乳鼠心肌细胞并用α-Actin免疫组化及电镜鉴定。
1.3 分组处理及 3 H-亮氨酸掺入率测定 按文献方法 ［3］ ，略加改进。将原代消化所得并经过纯化的心肌细胞密度调整至约3.0×10 6 /ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，48h后换为无血清培养液，加干预因素及 3 H-亮氨酸0.5μCi/孔，分为7组:Control对照组、NPY10 -9 M终浓度组、NPY10 -8 M终浓度组、NPY10 -7 M终浓度组、NPY10 -6 M终浓度组、NE10 -7 M终浓度组、NE10 -7 M+NPY10 -7 M终浓度组。每组n=6。每24h更换一次培养液，按实验规定的时间培养后，加0.25%胰蛋白酶0.3ml/孔消化细胞，血球计数板计数，在负压吸引器上将细胞转至49型玻璃纤维滤纸，PBS5ml×2次冲洗滤纸，以洗去游离的 3 H-亮氨酸，10%三氯醋酸破碎细胞并固定于膜上，80℃30min烤干滤纸，置5ml液闪杯中，静置平衡过夜，LS-6500型液体闪烁计数仪测定cpm值，以cpm/10 5 细胞表示 3 H-亮氨酸的掺入率。
1.4 统计学处理 所有数据以均值±标准差（ˉx±s）表示，应用Eztate2统计软件进行方差分析、t检验。结果以P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著。
2 结果
2.1 NPY作用浓度与 3 H-亮氨酸掺入率的关系 见图1。当NPY浓度为10 -9 M时， 3 H-亮氨酸掺入率即明显增加，与对照组相比差异有显著性（P<0.05），随着NPY浓度的提高， 3 H-亮氨酸掺入率呈剂量依赖性地增加，到10 -7 M浓度时基本稳定（图1）。
2.2 NPY作用时间与 3 H-亮氨酸掺入率的关系 见图2。NPY促进 3 H-亮氨酸掺入率增加的作用在一定范围内随时间延长而增强，在10 -8 M浓度下作用下24h， 3 H-亮氨酸掺入率即比对照组增加2倍，差异有非常显著性（P<0.01），其时间-效应曲线如图2所示。
2.3 不同刺激因素对心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率比较 见图3。（1）NE10 -7 M使心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率明显增加，与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），见图3。（2）NPY10 -7 M与NE10 -7 M合用时，心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率进一步增加，与NPY10 -7 M组、NE10 -7 M组相比差异均有非常显著性（P<0.01），见图3。
图1 NPY促心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入量-效关系图（略）
图2 NPY促心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入时-效关系曲线（略）
图3 不同刺激因素对心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率比较（略）
3 讨论
心脏肥大是临床心血管疾病常见的一种体征，主要表现为心室的肥厚，在临床心室肥厚以左室肥厚为多见，高血压病是左心室肥厚的最常见原因。多项研究表明过度的心室肥厚关联着心肌-毛细血管匹配失常、冠状动脉储备功能降低、心室腔几何形状改变以及心肌电活动改变等病理变化，是发生充血性心力衰竭和猝死的独立危险因素。心脏是包括心肌细胞、成纤维细胞、胶原、神经、血管、淋巴管等多种组织结构的复杂器官，心脏的肥厚是心肌细胞肥大生长、质量增加与间质增生的共同结果，其中，心肌细胞质量占心脏总质量的70%～80%，心肌细胞肥大是心脏肥厚的重要部分。目前认为，除压力负荷外，各种激素、生长因子在心脏肥厚的发生、发展中起了重要的作用 ［4］ 。
NPY是1982年从猪脑中提取出来的一种含36个氨基酸的多肽，为非肾上腺非胆碱类神经分泌的递质，心脏、血管组织中均有能分泌NPY的此类神经纤维存在，且心肌细胞、血管平滑肌细胞上都存在其特异的受体 ［5］ 。NPY对血管平滑肌细胞的作用目前较明确的有:（1）可直接收缩血 管;（2）增强血管对缩血管物质的反应性;（3）减轻血管对缩血管物质的脱敏性;（4）减弱血管对舒血管物质的反应性;（5）促进血管平滑肌细胞的增殖等;且其在高血压病患者、心力衰竭患者、自发性高血压大鼠血浆中含量明显升高，在高血压病、心力衰竭的发病过程中发挥了重要作用 ［6］ 。
关于NPY对心脏的作用，结论不太一致 ［7］ 。本实验采用培养的心肌细胞为模型，以NPY为直接刺激因素，排除了完整心脏研究中心肌继发性缺血和心脏内其它递质的影响，直接观察NPY对心肌细胞生长的影响，初步探讨NPY对心肌细胞肥大生长的影响及心肌细胞肥大过程中的部分调控机制，以期能从心肌细胞生长方面对心脏肥厚的机制有所阐明，为临床的防治提供理论指导。
3 H-亮氨酸掺入率测定细胞内蛋白质合成是一种经典的细胞生物学实验方法，亮氨酸是必需氨基酸之一，是细胞内蛋白合成的底物，其掺入细胞水平与细胞蛋白合成水平呈正相关。结果表明，NPY呈剂量依赖性地增加心肌细胞中 3 H-亮氨酸掺入率，10 -7 MNPY作用12h， 3 H-亮氨酸掺入率即显著增加，且在一定范围内随时间延长而渐增，与对照组相比差异有非常显著性。提示其促进了心肌细胞的蛋白合成速度，具有明显的促心肌细胞肥大作用。
心肌细胞膜上存在特异的NPY受体，初步推测其生物学作用的发挥机制为NPY作用于心肌细胞膜上的特异性受体，触发胞内的生理生化改变，并将此信号逐步传递到胞内的反应部位，引起细胞的生长肥大效应。
在神经系统中，NPY主要存在于交感神经系统中，并由交感神经末梢和NE一同分泌 ［8］ ，二者的分泌影响调节有一定的相似性，有报道可乐定在抑制NE释放的同时，还减少了NPY的释放。
NE是心血管功能调节的重要体液因素，已被多次证实可促进心肌细胞生长肥大 ［9］ ，此结论已无争议。本研究中发现，NE与NPY合用时，心肌细胞 3 H-亮氨酸掺入率进一步增高，较NE、NPY单独使用时有显著性的差异，说明二者至少在促心肌细胞肥大效应上具有明显协同效用，另外也说明在进行试图减弱此种效应的治疗过程中，同时阻断NE、NPY较单一阻断具有更积极的意义。
【参考文献】
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9 Patel MB，Loud AV，Hintze TH.Norepinehrine induced myocardial hypertrophy in conscious dogs.J Mol Cell Cardiol，1989，21（suppl）:49-62.
作者单位:1100089北京，解放军第466医院内二科
2400000重庆，第三军医大学大坪医院心内科
（编辑:李 弋）