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【摘要】 目的 研究产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因水平转移中的作用。方法 采用PCR方法检测产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布及经质粒转移的情况。结果 产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32. 9%；产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因, bla SHV+ CTX基因检出率为12.9%、blaCTX+TEM为9.8%、 blaSHV +TEM为8.7% 和 blaSHV+ CTX+ TEM为5.2%。结论 产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因与整合子具明显相关性；整合子携带着1个以上的多个耐药基因盒,与宿主菌的多重耐药性密切相关。
【关键词】 耐药基因 超广谱β内酰胺酶 整合子
Study on distribution of classⅠintegron and resistant genotypes of ESBLs in ESBLs-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
XU Lin , DI Xiao-hui, XU Jing-feng,et al.General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700,China
【Abstract】 Objective To study the distribution of class Ⅰintegron in extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and its contribution in horizontal transfer of ESBLs genes.Methods The presence of class Ⅰintegron among ESBLs-producers and non-ESBLs-producers of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by polymer asechain reaction(PCR).The correlation and co-transfer between integron and genes coding for SHV, CTX and TEM were studied.Results The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was 58.2%、74.7%、32. 9% respectively; bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM and blaSHV+ CTX+ TEM was 12.9%、9.8%、8. 7%、5.2% respectively. Conclusion The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was related with class Ⅰintegron;The integron with antibiotic resistance gene cassette contributes to multidrug resistance in ESBLs-producing strains.
【Key words】 antibiotic resistant gene; ESBLs; integron
ESBLs是导致革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。质粒、转座子和整合子对耐药基因在细菌间的水平转移起着重要作用。整合子可特异性地俘获和表达外源基因盒,并以质粒或转座子为载体在细菌间移动,导致耐药基因的快速和广泛播散。整合子可携带对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺等耐药基因盒。整合子大致可分为Ⅳ类,其中Ⅰ类在捕获和表达耐药基因中最常见。因此本文通过研究产ESBLs菌株中Ⅰ类整合子的分布和性质,明确菌株的播散趋势,有效监控细菌耐药。由于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是临床最常见的产ESBLs菌,其中CTX-M、SHV和TEM是最常见的ESBLs型别，本文对我院2006年肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的临床分离株,检测Ⅰ类整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布,明确Ⅰ类整合子在产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的流行和播散中的临床意义。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌均为我院临床标本中分离并按全国统一操作规程［1］。标本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。
1.2 仪器试剂 VITEK-2型全自动微生物分析仪、ID-GN 鉴定卡、AST-GN09药敏卡由法国Bio-Merieux公司生产; VITEK 比浊计(V 1210) 由日本生产；PCR扩增仪为美国PERKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；日本三洋MDF型超低温冰箱;德国Hettich公司22R型低温超速离心机;美国水套式恒温培养箱。
1.3 菌种鉴定、药敏 所有实验菌株分离纯化后按VITEK-2的使用要求配制成菌悬液和稀释液, 分别填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2仪器自动完成细菌的鉴定和药敏试验。
1.4 质控菌株 由卫生部临床检验中心提供的标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853) , 药敏质控结果符合NCCLS 药敏质控要求。
1．5 超广谱β内酰胺酶（ESBLs）检测 按照NCCLS 2000年版推荐的纸片扩散表型确证法进行检测。用肺炎克雷伯菌 ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌 ATCC2592为阴性对照。
1.6 耐药基因的检测 采用碱裂解法和蛋白酶K法提取被测细菌的质粒和染色体基因,提取方法根据不同引物设立不同PCR条件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大肠埃希菌分别作SHV型和TEM型阳性对照。
1．7 质粒接合转移 将产ESBLs菌株和大肠埃希菌培养到对数生长期,按6：1（v/v）接种,37℃培养,用含头孢噻肟(1μg/ml)的培养基筛选接合菌,制备模板用于PCR扩增。
1.8 PCR耐药菌基因［2］ 根据GenBank公布的Ⅰ类整合子整合酶基因和blaSHV、blaCTX和blaTEM基因序列，采用Primer软件设计引物(表1)。反应体系均为25μl,其中缓冲液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超纯水18.75μl 。根据不同引物设立不同PCR反应条件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型阳性对照，以TEM-26型大肠埃希菌作TEM型阳性对照,产物经电泳,在紫外线下观察结果,并在凝胶上成像。
1.9 DNA序列分析［3］ PCR扩增的基因片段经电泳后,切下相应条带纯化,进行DNA测序,结果在GenBank序列数据库进行同源性分析(BLASTN)。
1．10 统计学处理［2］ 细菌耐药性分析用 WHONET5软件进行分析，耐药率差异有显著性，用SPSS10.0统计软件分析,两组耐药率比较应用χ2检。表1 用于检测耐药基因的引物
2 结果与分析
2．1 ESBLs检出结果及耐药率 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌共检出ESBLs 194株，占40.３%,非产ESBLs细菌为288株占59.7%。产ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素的平均耐药率为74.1%,明显较非产ESBLs株平均耐药率47.9%高(P<0.05)。产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌除头孢替坦外，对其他头孢类抗生素的耐药率均在90%以上；对β内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、氨曲南和哌拉西林的耐药率为100%，仅对美洛培南和亚胺培南二种抗生素未产生耐药；产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.05)(表2)。表2 产ESBLs和非产ESBLs菌对抗生素的耐药率
2．2 产ESBLs菌株的PCR检测 对13株产ESBLs菌株(其中8株大肠埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PCR产物测序，其中blaTEM阳性的扩增产物为TEM-1基因, blaCTX阳性的扩增产物为CTX-M-3基因,而blaSHV阳性的扩增产物则分别为SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR琼脂凝胶电泳如图1～3。图1 TEM基因PCR扩增电泳图图2 SHV基因PCR扩增电泳图(1： DNA分子量标志,2000bp梯带；
2:阴性对照；3～5:临床菌株。)
图3 CTX基因PCR扩增电泳图
2.3 blaTEM、blaCTX和blaSHV的基因检测结果 产ESBLs菌株的blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32. 9%，产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因如bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM 和 blaSHV+ CTX+ TEM基因检出率分别为12.9%、9.8%、8.7%和5.2%。其中93株产ESBLs大肠埃希菌中, blaTEM基因检出率为81.7% (76/93), blaCTX基因检出率为94.6% (88/93), blaSHV基因检出率14.0% (13/93)，blaSHV+ CTX基因检出率12.9% (12/93)， bla CTX+ TEM基因检出率8.6% (8/93)，blaSHV +TEM基因检出率9.7% (9/93), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因检出率4.3% (4/93)。101株产ESBLs肺炎克雷伯菌中, blaTEM基因检出率为36.7% (37/101), blaCTX基因检出率为56.4% (57/101), blaSHV基因检出率为50. 5% (51/101), blaSHV+ CTX基因检出率12.9% (13/101)， bla CTX+ TEM基因检出率10.9% (11/101)，blaSHV +TEM基因检出率7.9% (8/101), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因检出率5.9 % (6/101)(表3)。
2．4 产ESBLs菌株阳性和阴性整合子对抗菌药物的耐药率 两组对头孢类抗生素如头孢他啶和头孢曲松的耐药率均>90%，经χ2检验P>0.05差异无显著性，而产ESBLs菌株阳性对头孢噻肟和头孢唑啉的耐药率也均>90%，但与整合子阴性的产ESBLs菌株比较P<0.05，差异有显著性。产ESBLs菌株阳性整合子对其他抗生素如氨苄西林和哌拉西林的耐药率均高于整合子阴性产ESBLs菌株,经χ2检验,差异有显著性(P<0.05)。两组对亚胺培南和美洛培南的耐药率均很低（表4）。表3 3种基因型PCR产物在产ESBLs菌株中的分布表4 产ESBLs菌株阳性和阴性整合子对抗菌药物的耐药率
3 讨论
大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，常寄殖于人体上呼吸道和肠道，是重要的条件致病菌和院内感染常见的病原体之一［4］。ESBLs主要在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现。本文ESBLs从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出率为40.3%。产ESBLs菌对常用抗生素的平均耐药率高达74.0%,对氨苄西林、环丙沙星、一二三代头孢菌素均具有很高的耐药率，产生了明显的多重耐药［5］。
由于ESBLs是质粒介导，可通过转化、转导、接合转移等方式传递而造成耐药菌流行。质粒、转座子和整合子对耐药基因在细菌间的水平转移起着重要作用［5，6］。本文用PCR检测产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子的分布,结果显示blaTEM阳性的圹增产物为TEM-1基因, blaCTX阳性的扩增产物为CTX -3基因,而blaSHV阳性的扩增产物则分别为SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12基因。blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32. 9%，说明产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因与整合子具明显相关性，但三者经质粒与整合子共同转移的频率不同。其中blaCTX的转移率最高,达到74.7%,其次为blaTEM（ 58.2%），blaSHV的转移率最低。提示本文中产ESBLs临床分离株中的blaCTX与整合子紧密相关。推测blaCTX可能位于整合子中或者与整合子位于同一个接合性质粒的遗传元件上，可能是ESBLs菌株遗传元件的主要流行方式。
本文71株产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因,其中bla SHV+ CTX基因检出率为12.9%、blaCTX+ TEM为9.8%、 blaSHV +TEM为8.7%和blaSHV+ CTX+ TEM为5.2%。说明整合子携带着1个以上的多个耐药基因盒,与宿主菌的多重耐药性密切相关。这可能揭示了本文中产ESBLs临床分离株对头孢类、β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素多重耐药的发生和转移机制［7］。也是导致整合子阳性株对三代和四代头孢菌素高耐药率的重要原因。
致谢：本文基因测序由北京华明公司基因检测室林丽华、王玉兰老师协助完成，特此感谢。
【参考文献】
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4 Hall MAL, Paauw A, Box ATA,et al. Presence of integron-associated resistance in the community is widespread and con-tributes to multidrug resistance in the hospital. J Clin Mi-crobiol, 2002, 40(8):3038-3040.
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作者单位：100700 北京，北京军区总医院