RP-HPLC法测定广东紫珠中熊果酸、齐墩果酸的含量

【摘要】  目的 采用RP-HPLC法同时测定广东紫珠中熊果酸、齐墩果酸的含量。方法 采用Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm），流动相为甲醇-1.0%冰醋酸水溶液（94：6）,检测波长为210nm，流速为0.5ml/min。结果 熊果酸和齐墩果酸分别在1.010～5.050μg (r=0.9964)和1.002～5.010μg (r=0.9983)范围内呈线性；熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为 99.69%(RSD=2.81%)和99.02%(RSD=3.01%)。结论 该方法简便、准确，重复性好，适用于广东紫珠药材中熊果酸和齐墩果酸的质量控制。

【关键词】  广东紫珠；　熊果酸；　齐墩果酸；　RP-HPLC法

    【Abstract】  Objective  The contents of ursolic acid and oleanolic acid in Callicarpa kwangtungenesis Chun was determined by RP-HPLC. Methods  The HPLC system consisted of Hypersil ODS2, mobile phase of methanol-1.0% acetic acid aquenous solution(96∶4) mixture, with detection at 210 nm, flow rate 0.5ml/min. Results  The linear ranges of determination of ursolic acid and oleanolic acid were 1.010～5.050 μg, r=0.99864 and 1.002～5.010 μg, r=0.9983 ,respectively, The recoveries were 99.69%(RSD 2.81%) for ursolic acid and 99.02%(RSD 3.01%)for oleanolic acid. Conclusion  The method is simple, accurate and with good reproducibility,for quality control of Callicarpa kwangtungenesis Chun.

    【Key words】  Callicarpa kwangtungenesis; Chun　ursolic acid;　oleanolic acid;  RP-HPLC

    广东紫珠为马鞭草科植物广东紫珠Callicarpa kwangtungenesis Chun的干燥地上部分。广东紫珠为传统中药，具有止血、散瘀、消炎；用于衄血、咯血、胃肠出血、子宫出血、上呼吸道感染、扁桃体腺炎、肺炎；外用治外伤出血、烧伤［1］。熊果酸和齐墩果酸为广东紫珠中的活性成分［2］，齐墩果酸毒性很低，具有多种生物活性—抗病毒、消炎，增强免疫和免疫调节、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、护肾、抗艾滋病毒等作用；特别对恶性肿瘤化疗造成功能下降的恢复和对抗结核药物的肝损害的保护意义重大［3，4］。熊果酸毒性小，具有多种生物学活性，在抗肿瘤、抗氧化、保肝、降血脂方面作用显著［3，4］。因此二者都具较高的开发和应用前景，其含量测定方法未见报道。笔者研究建立了HPLC法同时测定广东紫珠中熊果酸、齐墩果酸的含量。该法准确、快速、灵敏，重现性好，可作为广东紫珠药材质量控制标准。

    1  仪器与试药

    Shimadzu LC-10AT泵；SPD-10A紫外检测器；Rheodyne 7125六通进样阀；浙江大学智能研究所N3000色谱工作站。熊果酸（110742-200212）、齐墩果酸（0709-9803）对照品（中国药品生物制品检定所）。甲醇（色谱纯），冰醋酸（分析纯）。水为二次重蒸馏水。广东紫珠由湖南怀化龙源药材公司市售,经本学院植物教研室鉴定为马鞭草科植物广东紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun的干燥地上部分。

    2  色谱条件

    色谱柱：Hypersil ODS2柱（250mm×4.6 mm），流动相：甲醇-1.0%冰醋酸溶液（94：6）,检测波长：210nm，灵敏度：0.005 AUFS，流速:0.5ml/min，　柱温：20℃。

    3  试验方法

    3.1  对照品溶液的配制  精密称取减压干燥至恒重的熊果酸对照品 5.05mg，齐墩果酸对照品 5.01mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品混合溶液，分别为 0.505mg/ml和 0.501mg/ml。

    3.2  样品预处理  取广东紫珠地上部分，阴干后经 50 ℃ 鼓风干燥 3h，粉碎。精密称取中粉5.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率150W，频率40kHz）40min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    3.3  线性关系考察  取上述对照品的混合溶液分别以 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl 进样分析，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值（Y）为横坐标、以对照品的进样量（X）为纵坐标作图，进行线性回归，得回归方程分别为：

    Y (熊果酸)=296607.5X-32752.6，r=0.9964

    Y (齐墩果酸)=290670.7X-15981.8，r=0.9983 

    结果表明熊果酸进样量在 1.010～5.050μg 范围内线性关系良好，齐墩果酸进样量在 1.002～5.010μg 范围内线性关系良好。

    3.4  精密度试验  精密吸取对照品混合溶液 10μl，重复进样5次，分别测定峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 1.62%，齐墩果酸的 RSD 为 1.48%。

    3.5  重复性试验  取5μl 同一浓度的含对照品的甲醇溶液，在上述色谱条件下连续进样 5 次，根据峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 2.51%，齐墩果酸的RSD 为 2.39%。

    3．6  稳定性试验  取供试品溶液，每2h进样1次，共测定6次，每次10μl，将峰面积代入回归方程，计算，样品中齐墩果酸和熊果酸的RSD值（n=6）分别为2.48%和2.67%；试验结果显示，供试品在12h内稳定性良好。

    3.7  加样回收率试验  精密称取干燥至恒重的广东紫珠中粉6份，每份 5g，其中 3 份加入已精密称定的熊果酸、齐墩果酸各 0.5mg，6 份样品同时提取，其方法同样品的预处理，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果熊果酸、齐墩果酸的加样回收率分别为 99.69%、99.02%；RSD 分别为 2.81%、3.01%。

    3.8  样品测定  分别精密吸取对照品混合溶液与不同批号广东紫珠药材（批号：070201、070401、070402）溶液各 10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标法计算出样品中熊果酸和齐墩果酸的含量，分别为结果见图1及表1。表1  广东紫珠中熊果酸及齐墩果酸含量         

    4  讨论

    4.1  选择测定方法考察  由于熊果酸和齐墩果酸均属三萜酸，且结构极为相似，两者极性几乎无差别，因此在薄层板上很难将两种成分分离开，从而无法建立薄层扫描法对其进行测定［3］。所以，本试验采用HPLC法。

    4.2  样品提取方法考察  对样品处理分别采用了超声提取法和水浴回流法进行比较，在同样的提取时间下，通过对含量测定，超声处理法提取熊果酸和齐墩果酸含量均高于水浴回流法，因此，本法采用超声提取法。同时，对超声提取时间进行了考察，超过40min后，两者的含量不再变化；故本法采用40min。从表1可以看出广东紫珠中熊果酸的含量高于齐墩果酸。

    本法简便易行、准确灵敏，适应范围广，可用于检验、评价广东紫珠及其产品质量及生产工艺控制。

【参考文献】
  1 湖南省中药材标准.长沙：湖南科学技术出版社,1993.

2 周伯庭，李新中，徐平声,等.广东紫珠地上部位化学成分研究.中南药学，2004,4:19.

3 张晓喻,黄春萍,张宏,等.反高效相色谱法测定四川不同产地枇杷花中齐墩果酸和熊果酸的含量.药物分析杂志,2007,27(1):129.

4 江记武，肖庆祥.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社，1986.

作者单位：1 416000 湖南吉首,湖南吉首大学生物资源与环境科学学院 2 418000 湖南怀化,湖南怀化正好制药有限公司