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摘要 目的:建立诃子中3种可水解丹宁的高效液相色谱测定方法。方法:色谱柱为NovaPak C18,流动相为甲醇-2%冰醋酸水溶液(27∶73),检测波长为280
nm,流速为1 mL.min-1。结果:3种可水解丹宁诃子酸(chebulinic
acid,Ⅰ),诃黎勒酸(chebulagic acid,Ⅱ)和1,3,6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose,Ⅲ)的线性范围分别为3.32~16.60
μg,3.48~17.40 μg和2.74~13.70 μg,回收率分别为100.3%,94.50 %和85.09%,精密度试验RSD分别为3.2%,3.4%和3.3%。结论:该法重现性较好,结果可靠,可为诃子药材的质量评价提供有效手段。 Determination of Three Hydrolyzable Tannins in the Fruits Liu Yanze,Ding
Gang,Ding Bingwu Abstract Objective:A
RP-HPLC method was developed for the determination of three hydrolyzable
tannins [chebulinic acid(Ⅰ),chebulagic acid(Ⅱ) and
1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose(Ⅲ)] in the fruits of Terminalia chebula
Retz. Methods:Using a NovaPak C18 column (3.9 mm×150 mm,4 μm)
in an oven at 30 ℃,with a solvent system consisting of
MeOH-2%HAc(27∶73)and a UV detector at 280 nm, the flow rate was 1
mL.min-1.Results:The linear ranges
of Ⅰ~Ⅲ were 3.32~16.60,3.48~17.40 and 2.74~13.70 μg respectively.The
average recoveries were 100.3% (RSD=2.8%,n=5),94.50% (RSD=2.3%,n=5) and
85.09% (RSD=4.1%,n=5) respectively. The RSDs (n=5) of measurement
precision test were 3.2%,3.4% and 3.3% respectively.Conclusion:The method
is reproducible, dependable and useful in quality evaluation of the crude
drug of Fructus Chebulae. 诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)及其变种绒毛诃子(T. chebula Retz. var. tomentella Kurt.)的干燥成熟果实,为药典收载品种。具有良好的涩肠止泻、降火利咽、调和药性、解毒等功效,临床应用广泛,尤其在藏药和蒙药中最为常用[1]。曾有报道根据诃子中没食子酸及总丹宁含量的高低来评价其药材质量[2],但对其中特征性丹宁成分的定量分析尚未见文献报道。根据我们研究证实,诃子酸(chebulinic acid)是诃子的主要有效成分之一,因此以诃子酸等可水解丹宁作为诃子药材质量评价指标具有较强的客观性。本文建立了诃子中3种可水解丹宁诃子酸(Ⅰ),诃黎勒酸(chebulagic acid,Ⅱ)和1,3,6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose,Ⅲ)的反相高效液相色谱测定法,为科学评价诃子药材质量提供有效手段。 1 仪器与材料 Waters高效液相色谱仪,包括510型泵,486检测器,Rheodyne
7725i/20 μL手动进样阀,PC-800
色谱工作站。组织破碎提取器(河南中医学院等研制)[3]。对照品Ⅰ~Ⅲ及鞣料云实素(corilagin)均为作者从诃子药材中提取、分离并经光谱鉴定,HPLC法检测纯度均在95%以上。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:NovaPak
C18(3.9 mm×150 mm,4 μm),保护柱(长1 cm);流动相:甲醇-2%冰醋酸(27∶73,);柱温:30
℃;流速:1 mL.min-1;检测波长:280
nm。 表1 Ⅰ~Ⅲ的线性关系(n=5) |
化合物 | tR/min | 回归方程 | 线性范围/μg |
Ⅰ | 10.38 | Y=5.008×10-7X+9.590×10-2 | 3.32~16.60 |
Ⅱ | 3.23 | Y=7.728×10-7X+6.196×10-2 | 3.48~17.40 |
Ⅲ | 2.01 | Y=4.115×10-7X+1.201×10-1 | 2.74~13.70 |
2.4 提取方法的确定 为防止可水解丹宁水解,我们采用室温组织破碎提取法[4,5]进行提取。准确称取诃子干燥果肉1.020
g,置于高17 cm,直径5.5 cm的玻璃杯中,加入70%丙酮150 mL室温组织破碎提取1 min,静置5
min,上清液减压抽滤,杂质用蒸馏水冲洗3次,所得滤液用旋转蒸发器于60
℃减压浓缩干至恒重,用减重法得出该次提取物重量,药渣同法再进行下一次组织破碎提取。结果,第1次提取出0.387 g,第2次提取出0.110
g,第3次提取出0.021 g,第4次提取出0.004
g。由此可见,组织破碎提取3次,已将诃子成分基本提尽。故确定采用组织破碎提取法提取3次。 2.5 样品液的制备 准确称取诃子干燥果肉粉末1 g,用70%丙酮室温组织破碎提取3次(150 mL×3),提取液减压抽滤,杂质用少量70%丙酮冲洗3次,滤液合并,置于500 mL容量瓶中,以70%丙酮定容。精密吸取提取液100 mL,于60 ℃减压浓缩至5 mL,上Toyopearl HW-40柱(1 cm,柱长20 cm,吸附剂高10 cm)进行低压柱层析,依次用蒸馏水50 mL,5%甲醇50 mL洗脱除去杂质(HPLC分析不含被定量成分),然后用甲醇-丙酮-水(6∶2∶2) 300 mL洗脱(至洗脱液FeCl3-铁氰化钾薄层显色反应为阴性),所得洗脱液于60 ℃减压浓缩至干,用甲醇(色谱纯)溶解并定容于5 mL容量瓶中,经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液进样5~10 μL进行HPLC分析,如果浓度超出或低于标准曲线的线性范围,则相应地稀释或浓缩至一定体积后,再进行分析。 2.6 Toyopearl HW-40的处理 先用1 mol.L-1 NaOH 20 mL通过Toyopearl HW-40层析柱, 蒸馏水洗至中性, 再用1 mol.L-1 HCl 20mL 通过层析柱, 蒸馏水洗至中性, Toyopearl HW-40即可重新使用。 2.7 方法精密度测定 平行称取诃子干燥果肉粉末5份,按“2.5”项下方法制备样品液,进行HPLC分析,用外标2点法测得Ⅰ~Ⅲ的浓度,计算Ⅰ~Ⅲ的RSD分别为3.2%,3.4%和3.3% 2.8 稳定性试验 同一样品液在室温(约15 ℃)下,天内测定3次,天间测定3 d,Ⅰ~Ⅲ天内测定的RSD分别为0.65%,1.3%和0.94%,天间测定的RSD均为2.5%。 2.9 加样回收率试验 平行准确称取诃子干燥果肉粉末1.0g 6份,其中1份作为对照,其余5份分别准确加入一定量的对照品,按“2.5”项下方法制备样品液,测定加样回收率,结果见表2。 |
图1 对照品1~4(A)和诃子样品(B)的HPLC图 表2 回收率试验(n=5) |
化合物 | 平均回收率/% | RSD/% |
Ⅰ |
100.3 |
2.8 |
Ⅱ | 94.50 | 2.3 |
Ⅲ | 85.09 | 4.1 |
2.10 样品分析 按“2.5”项下方法制备样品液,进样分析,用外标2点法计算Ⅰ~Ⅲ的百分含量,测定3次,结果见表3。 表3 诃子中Ⅰ~Ⅲ的含量(n=3) |
化合物 | 含量/% | RSD/% |
Ⅰ |
7.28 |
0.72 |
Ⅱ | 13.06 | 0.16 |
Ⅲ | 2.50 | 0.56 |
3 讨论 3.1 由于诃子干燥果肉较为坚硬,溶剂难以渗透,其中可水解丹宁成分稳定性较差,在提取过程中易分解破坏。本实验采用的室温组织破碎提取法可有效解决上述问题,且较超声提取法更为快速、有效。 国家九五攻关项目“中药材质量标准的规范化研究-诃子” 参考文献 1,李志恒,那生桑,赫向峰.
诃子在蒙医药中的独特应用. 中医药信息, 1994,11(4):34 (本文于1999年8月2日收到) |