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【摘要】 目的 用实时荧光定量RT-PCR的方法测定PBC患者外周血中GNLY的基因表达水平，探讨GNLY在原发性胆汁性肝硬化（PBC）的表达及意义。 方法 采用Taqman探针技术，以18sRNA为内对照，测定了60例PBC性心脏病患者外周血中GNLY mRNA的含量，以健康对照组为对照。结果 GNLY mRNA在60例PBC患者的表达范围为5.35×107～4.61×109拷贝/μg RNA，均值为（2.7±2.5）×108拷贝/μg RNA；100例健康对照者均值为（3.0±1.9）×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的含量显著高于疾病对照乙型肝炎肝硬化组和健康对照组（P<0.01）。结论 通过FQ-PCR方法检测出PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组，GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。
【关键词】 PBC； GNLY；逆转录-聚合酶链反应
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种原因不明的自身免疫性肝病，胆小管出现进行性破坏性炎症反应，肝内出现慢性胆汁淤积，进一步发展成肝纤维化和肝硬化，最终患者只能依靠肝移植免于死亡［1］。PBC患者胆管破坏伴随着门脉淋巴细胞浸润，主要为活化的CD8+T和CD4+T细胞，CD8+T细胞介导的免疫反应参与PBC中胆管上皮细胞和肝细胞破坏的发病过程［2］。颗粒溶素（granulysin，GNLY）是NK（natural killer，NK）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表达的一种溶细胞分子，在机体免疫应答过程中，它先通过胞吐作用从胞浆颗粒中排出，然后在胞外发挥其细胞毒作用［3］。本研究主要是利用实时荧光定量RT-PCR的技术，建立一种灵敏快速地检测GNLY 基因表达的方法，并从分子水平探讨GNLY mRNA 在PBC患者外周血中的表达及临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 60例经临床确诊的PBC患者均为长征医院住院病人，其诊断均符合美国肝病学会（AASLD）2000年推荐的PBC诊断标准［4］，其中男5例，女55例，男女比例为1：11，发病年龄（45.6±10.2）岁。正常对照组为100例健康体检者。
1.1.2 主要仪器和试剂 RNeasy Mini Kit（QIAGEN），Taqman Reverse Transcription Regents （Applied Biosystem），淋巴细胞分离液（上海生化试剂公司）， TaqMan 2×PCR Master Mix，Taqman Reverse Transcription Regents （Applied Biosystem），引物及TaqMan水解探针的合成（上海生工）、DNA测序分析（上海联合基因生物技术公司）。GeneAmp 7900 Sequence Detection Systems（美国PE Biosystems公司）。
1.1.3 引物、探针的设计与合成 用Beacon Designer 2.1软件设计GNLY和18s rRNA的基因专一性的引物和探针，GNLY上游引物：5’ACT GAA GAA GAT GGT GGA TAA GCC 3’；下游引物：5’GCC CTG GGT AAC TCT AGA CTG A3’；探针: FAM CGG AAC CTC CAG TCA GAA GAC CAG A TAMRA。内参18s rRNA上游引物：5’ ACA TCC AAG GAA GGC AGC AG 3’；下游引物：5’TTC GTC ACT ACC TCC CCG G 3’；探针:FAM CG CGC AAA TTA CCC ACT CCC GA TAMRA。正反向引物、Taqman探针（FAM TAMRA标记）均由上海生工生物技术公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 抽提外周血单个核细胞和总RNA 取枸橼酸钠抗凝静脉血5ml，用淋巴细胞分离液得到PBMC，QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测所提取的总RNA的质量和浓度，并计算RNA的含量。
1.2.2 cDNA的合成 反转录按试剂说明书操作，反转录体系如下：RNA 2.85μl， 10×Taqman RT Buffer 1.0μl，40mM Magnesium Chloride 2.2μl，deoxyNTPS Mixture 2.0μl，Random Hexamers 0.5μl， RNAase Inhibitor 0.2μl， MultiScribe Reverse 0.25μl， Transcriptase RNase-free water 1.0μl ，共10μl的反转录体系，42℃45min → 94℃3min终止反应。cDNA保存于-20℃备用。
1.2.3 定量阳性模板和内参照模板的制备 PCR反应体系如下：蒸馏水 34.7μl，10×Ex buffer 5μl，ExTaq酶0.3μl，dNTP 4μl，上下游引物各2μl，cDNA 2 μl， GNLY和18s rRNA的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化，将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行连接构建重组质粒pMD18-T-GNLY和pMD18-T18s rRNA进行酶切及测序鉴定。
1.2.4 绘制标准曲线 将质粒pMD18-T-GNLY和pMD18-T-18s rRNA经紫外分光光度仪测定浓度换算出拷贝数，用TE缓冲液以1:10比例稀释成各种不同拷贝数浓度。上述不同稀释度的两种标准模板1μl，2×buffer 5μl ， GNLY或18s rRNA上、下游引物各0.2μl， Taqman探针0.2μl，无RNA酶水3.4μl，共10μl反应体系。扩增条件均为50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min 40个循环。反应结束后计算机自动绘制出GNLY和内参18s rRNA的标准曲线。
1.2.5 定量PCR检测GNLY的表达 将阳性模板、患者和对照组的cDNA在GeneAmp 7900上进行扩增。反应结束后，PCR仪自动计算出各样本GNLY基因的拷贝数。
1.2.6 统计学处理 计量资料用x±s表示，多组资料之间比较用方差分析，两组之间比较采用t检验。
2 结果
2.1 标准曲线的绘制和内对照的设定 将不同稀释度的阳性标准模板同时进行定量PCR检测，将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT（ Cycle threshold，阈循环）值处。将CT值与其对应的不同定量模板的对数拟合作图，其中横坐标代表不同定量模板起始拷贝数的对数（log10），纵坐标代表Ct值，得出一条定量标准曲线。GNLY和18s rRNA标准曲线相关系数都达0.996。
2.2 GNLYmRNA在各组PBC患者和健康对照者中的表达量 所有标本均重复检测两次取均值，根据软件所得基因拷贝数和各样本RNA浓度，将结果换算为拷贝数/μgRNA。各组GNLY mRNA含量的定量检测结果如表1所示，PBC组GNLY mRNA的表达量显著高于健康对照组（P<0.01）和疾病对照乙型肝炎肝硬化组（P<0.01）。而乙型肝炎肝硬化组GNLYmRNA的含量低于健康对照组（P<0.01）。
表1 各试验组GNLY mRNA含量的定量检测结果 （略）
3 讨论
1991年Holland等首次建立了荧光定量PCR的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，信号的强弱代表了模版的数量。荧光定量PCR以其特异性强、重复性好、定量准确、操作简便等优点成为研究基因表达的重要手段［5］。
原发性胆汁性肝硬化（PBC）是）是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征的慢性胆汁淤积性疾病，最终发展为肝硬化的自身免疫性肝病。90％以上的患者血清中出现抗线粒体抗体（AMA）。GNLY由NK，CTL释放，在机体免疫应答过程中，与穿孔素、颗粒酶一起排出胞外，参与抗菌、抗病毒、杀伤肿瘤细胞等免疫过程。国外有学者研究在肾移植急性排斥患者的尿沉渣和外周血中GNLY表达增高［6］，但是在自身免疫病中未见相关报道。本研究采用定量PCR技术检测了60例PBC患者、60例乙型肝炎肝硬化患者和100例健康对照者PBMCs上GNLY mRNA的表达量。实验结果表明PBC组外周血GNLY mRNA表达与正常健康组和疾病对照乙型肝炎肝硬化组比较有显著性增高（P<0.01），同时乙型肝炎肝硬化组GNLY mRNA表达低于正常健康组（P<0.01）。提示PBC疾病进展过程中CTL、NK细胞均被激活，其中CTL的T细胞受体（TCR）免疫识别表达在胆管上皮细胞上的MHC-抗原肽复合物后，向靶细胞释放GNLY发挥杀伤效应，导致CTL细胞对肝组织的细胞毒效应加强，胆管上皮细胞死亡，释出自身抗原。
本实验利用实时荧光定量RT-PCR的技术，首次证实了GNLY mRNA 在PBC患者中的表达上调，提示GNLY及其介导的细胞免疫应答与PBC的发生发展存在一定相关性。GNLY能否作为PBC早期诊断、病程监测及判断预后的指标，仍需要进一步研究探索。
【参考文献】
1 Talwalkar JA， Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet， 2003，362:53-61.
2 Tinmouth J， Lee M， Wanless IR， et al. Apoptosis of biliary epithelial cells in primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. Liver， 2002，22: 228-234.
3 Pena SV，Krensky AM.Granulysin， a new human cytolytic granule-associated protein with possible involvement in cell-mediated cytotoxitity. Semin Immunol，1997，9（2）:117-125.
4 Heathcote FJ. Management of primary biliary cirrhosis.The American Association for the Study of Liver Disease practice guidelines.Hepatology，2000，31:1005-1013.
5 Giulietti A， Overbergh L， Valckx D， et al. An overview of real-time quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression. Methods， 2001，25:386-401.
6 Kotsch K， Mashreghi MF， Bold G， et al. Enhanced granulysin mRNA expression in urinary sediment in early and delayed acute renal allograft rejection. Transplantation，2004， 77（12）:1866-1875.
作者单位： 200003 上海，第二军医大学附属长征医院实验诊断科、全军临床免疫中心
基金项目：本课题受国家自然科学基金（30471616）、上海市重大科技攻关基金（04DZ19116）、上海市重点科研支撑条件项目（0511009012）和上海市青年科技启明星计划（QMX01423）资助
（编辑：邓 锋）