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【摘要】 目的 重组表达人OGDC-E2融合蛋白，并用于检测自身抗体。方法 重组表达的OGDC-E2，分别采用免疫印迹法（IBT）法和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测PBC患者的M2抗体。50例确诊的PBC患者为PBC组，以其他肝病患者70例、自身免疫病患者70例和健康体检者70例作对照。结果 50例确诊的PBC患者中41例OGDC-E2抗体阳性，9例阴性，阳性率为82.0%。而疾病对照组和健康体检者血清中M2抗体检测均为阴性。结论 用重组人2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体，有较好的敏感性及一定的特异性，有助于临床对PBC的诊断。
【关键词】 2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2亚单位；原发性胆汁性肝硬化；免疫印迹法；酶联免疫吸附试验；自身抗体
Detection of anti-M2 autoantibody using recombinant OGDC-E2
CHEN Yan,YAO Ding-kang,ZHOU Ye,et al.Labortary
Diagnostics,Changzheng Hospital,The Second Military Medical
University,and Clinical Immunology Center of PLA,Shanghai 200003,China
【Abstract】 Objective To detect the level of anti-M2 autoantibody using recombinant OGDC-E2.Methods We purified recombinant OGDC-E2 by Ni2+ affinity chromatography column and then established Western blotting test(WBT) and enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) to detect anti-M2 autoantibody in the sera of patients with primary biliary cirrhosis(PBC).Results Among 50 sera from PBC patients,41 were positive,all of controls were negative.Conclusion The recombinant OGDC-E2 could be used to detect anti-M2 autoantibody specially and sensitively,helpful for diagnosis of PBC.
【Key words】 OGDC-E2;primary biliary cirrhosis;immunoblotting;enzyme linked irnmunosorbent assay;autoantibody
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC)是一种自身免疫性疾病，主要表现为肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致肝纤维化及肝硬化［1］。高滴度的抗线粒体抗体（AMA）是本病的特征，而M2又是PBC的特异性抗体。2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC-E2）为M2的靶抗原的组分之一。OGDC-E2的抗原表位位于内酯酰区，在PBC患者血清中的阳性率为39%~88%［2，3］。笔者采用免疫印迹法（IBT）和酶联免疫吸附试验（ELISA），探讨用重组抗原OGDC-E2检测M2抗体在PBC诊断中的应用价值，为PBC的早期发现和临床诊断提供依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象 2003年4月~2005年8月在我院就诊并被确诊为PBC的患者50例为观察对象（PBC组），其中男3例，女47例，男女比例为1∶16。年龄42~69岁。以2005年间在我院就诊的其他肝病患者70例、自身免疫病患者70例、健康体检者70例作对照。
1.2 诊断标准 PBC的诊断符合2000年美国肝脏病学会（AASLD）推荐的诊断指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变（主要是碱性磷酸酶、γ-谷胺酰转肽酶升高）且无其他原因解释；血清抗线粒体或M2抗体阳性；同时AMA≥1∶40［4］。
1.3 方法
1.3.1 重组抗原纯化 将特异性扩增OGDC-E2 cDNA并定向插入高效 表达载体PET28a(+），转导入宿主菌E.coli.BL21，经IPTG诱导后表达，在变性条件下用带6个组氨酸的Ni-NTA琼脂糖纯化，获得高纯度的重组OGDC-E2［5］。
1.3.2 重组融合抗原IBT侧M2抗体 将重组蛋白OGDC-E2经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的PBS（pH 7.4）封闭1h；而后依次加入血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗人IgG抗体，加入3，3-二胺联苯胺溶液和30%H2O2，观察反应条带。同时用正常人血清作阴性对照。
1.3.3 ELISA测M2抗体 重组融合抗原OGDC-E2包被微孔板，首次将血清作1∶15稀释进行常规ELISA检测，测A450nm。对超过1个A450nm值者继续作系列稀释。设相应的血清稀释液抗原抗体，反应产物在450nm产生的1个吸光度A值为1个抗体单元（U），各样品抗体单位为A值数字X稀释倍数。
1.4 统计学方法 用Student's检验分析组间差异。
2 结果
2.1 重组融合抗原TBT法检测结果 经IBT反应证明，重组融合抗原能与抗OGDC-E2血清反应，与其他抗血清无交叉反应。50例确诊的PBC阳性病人中，检测出抗OGDC-E2抗体阳性的为41例，阴性9例。正常对照和其他肝病患者抗OGDC-E2抗体均为阴性。而70例自身免疫病患者中，6例AMA阳性，但其血清中抗OGDC-E2抗体均为阴性。见表1。表1 抗OGDC-E2抗体与AMA抗体
2.2 ELISA方法检测重组融合抗原结果 在ELISA检测时，正常对照组值为（76±40）U，因此以大于276U（x±5S）为阳性标准，小于276U为阴性标准。结果显示，经常规试剂盒和IBT法检测M2阳性的41份血清，用ELISA方法检测均为阳性，其余9例均为阴性，其结果完全吻合。
3 讨论
原发性胆汁性肝硬化（PBC）系一种慢性进行性肝内小胆管炎症性疾病，病因尚不清楚。多见于中年女性，女性与男性之比约10∶1，平均发病年龄约50岁。临床表现有乏力、纳差、皮肤瘙痒、黄疸和肝脾肿大。PBC一直被认为是罕见病。近年来由于免疫学、分子生物学、免疫病理学等学科的发展，尤其是自身抗体研究的突飞猛进，国内已陆续发表了PBC的临床分析。
PBC是一种与自身免疫应答异常有关的肝脏疾病，患者血清中有高滴度抗线粒体抗体（AMA），AMA作为PBC最突出的异常免疫学指标，其阳性率可达到95%以上，因此对PBC的诊断有重要意义［6］。高滴度的抗线粒体抗体（AMA）是本病的特征，AMA可被分为M1~M9共9个亚型，其中只有M2为PBC的特异性抗体。2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位（OGDC-E2）为M2的靶抗原的组分之一。OGDC-E2的抗原表位位于内酯酰区，在PBC患者血清中的阳性率为39%~88%。
国内有关采用2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC-E2）来检测M2抗体的报道较少，因此我们通过用重组人OGDC-E2检测M2抗体，以期为PBC的早期临床诊断提供一些辅助参考的手段。结果显示50例确诊的PBC患者中41例阳性，9例病人阴性；70例其他肝病患者和70例健康体检者均为为阴性，70例自身免疫病患者中6例检测出AMA阳性，但其抗OGDC-E2抗体均为阴性。表明用OGDC-E2来检测M2抗体对PBC的诊断具有较好的敏感性和特异性，值得进一步研究和推广应用。
通过用重组的人2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位，作为靶抗原检测病人血清中的抗体，辅助诊断原发性胆汁性肝硬化，以利于排除其他疾病，为PBC的早期诊断提供一些参考。
【参考文献】
1 Yabushita K. Aberant expression of cktokeratin7 as a histological marker of progression in primary biliary cirrhosis. Liver,2001,21(1):50.
2 Miyakawa H, Kikuchi K. Jong-Hon K, et al. High sensitivity of a novel ELISA for anti-M2 in primary biliary cirrhosis. J Gastroenterol,2001,36(1):3-38.
3 Jong-Hon K, Yajima R, Karino Y, et al. Development of a new enzyme-linded immunosorbent assay for the detection of anti-M2 in primary biliary cirrhosis. Hepatol Res,2001,21(1):1-7.
4 Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The amercian association for the study of liver diseases practice guidelines. Hepatology,2000,31(4):1005-1013.
5 夏晴，仲人前，邓安梅，等.胰腺癌相关自身抗原47原核表达、纯化及其抗体检测胰腺癌的价值初探.中华检验医学杂志,2003,26(4):222-225.
6 王吉耀,蒋炜,高虹,等.原发性胆汁性肝硬化的临床及病理学特征.中华肝脏病杂志,2002,10(5):334-337.
*基金项目：本课题受国家自然科学基金（30471616）、上海市重大科技攻关基金（04DZ19116）、上海市重点科研支撑条件项目（051409012）和上海市青年科技启明星计划（QMX01423）资助。
作者单位： 200003 上海，第二军医大学长征医院实验诊断科，全军临床免疫中心（△通讯作者）
(编辑：萧 凝)