生物检材中利血平的高效液相色谱/质谱和高效液相色谱的检测

【摘要】 目的：建立生物检材中利血平的高效液相色谱/质谱(HPLC/MS)和高效液相色谱(HPLC)的检测。方法：采用C18(200 mm×4.6 mm，5 mL)色谱柱，乙腈∶水(40∶60)用盐酸调节pH值至3.00±0.05为流动相，检测波长258 nm。结果：HPLC/MS分析利血平的选择离子m/z为608，195。心血中利血平HPLC检测的回归方程、线性检测范围、相关系数、回收率、最低检出浓度，分别为Y=56.576X+0.3168( μg/mL)，(0.5～48) μg/mL，0.995，(96.50±3.0)%，0.5 μg/mL;肝组织中利血平HPLC检测的回归方程、线性检测范围、相关系数、回收率、最低检出浓度，分别为Y=38.567X+0.054(μg/g)，(0.5～48) μg/g，0.984，(97.5±2.5)%，0.5 μg/g。染毒大鼠心血、心、肝、脾、肺、肾和脑中利血平的含量依次为：(316.39±6.43)，(284.96±3.03)，(353.82±7.73)，(185.74±4.07)，(221.64±1.38)，(215.94±2.87)，(170.15±7.05) μg/g。结论：生物检材中HPLC/MS检测方法选择性好，定性准确，HPLC检测简便，快速，灵敏，定量结果准确，可用于利血平中毒的临床快速检验诊断和利血平中毒死亡案件的法医学鉴定。

【关键词】  高效液相色谱法;高效液相色谱/质谱法;利血平;生物检材

The analysis of reserpine in biomaterial by HPLC/MS and HPLC

　　ZHAO Chengrui1，WANG Yong2，WANG Zheyan2

　　(1.Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China;2.School of Forensic Medicine，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

　　Abstract Objective：To establish the method for detecting the reserpine in biomaterial by HPLC and HPLC/MS.Methods：The chromatographic system consisted of C18 column and mobile phase of acetonitrile;water(adjusting the pH to 3.00±0.05 with hydrochloric acid)(40∶60).The detection wavelength was set at 268 nm.Results：The m/z of selected ion of reserpine was 608，195 by HPLC/MS.The linear range of reserpine in biomaterial by HPLC was 0.5 μg to 48 μg/mL or μg/g.The regression equation，linear range，correlation coefficient，recovery rate，limit of detection of reserpine in heart blood was Y=56.576X+0.3168(μg/mL)，(0.5～48) μg/mL，0.995，(96.50±3.0)%，0.5 μg/mL;and in liver was Y=38.567X+0.054(μg/g)，(0.5～48) μg/g，0.984，(97.5±2.5)%，0.5 μg/g respectively.The concentrations of reserpine after administration for 3 h in heartblood，heart，liver，spleen，lung，kidney，and brain were (316.39±6.43)，(284.96±3.03)，(353.82±7.73)，(185.74±4.07)，(221.64±1.38)，(215.94±2.87)，(170.15±7.05) μg/g.Conclusion：This method is more selective，more sensitive，simpler，more accurate，and can be applied not only to clinical diagnosis of reserpine poisoning，but also to forensic identify of reserpine poisoning death.

　　Key word HPLC;HPLC/MS;reserpine;biomaterial

　　利血平(Reserpine)是一种常用的抗高血压药物，以其显著的降压效果、低廉的价格为高血压患者广泛使用[1]。由于临床应用较广，用药过量会造成严重药物不良反应，也有自杀和他杀的报道[2～4]，临床和法医工作中常需快速定性、定量检测血和其他生物检材中利血平。目前的研究主要集中于利用高效液相色谱(HPLC)法进行利血平成分的确定及含量的测定，目的是为了更有效控制产品质量，保证患者用药安全[5～7]。生物组织中利血平的检测方法报道较少。本文建立生物检材中利血平的HPLC/MS(高效液相色谱/质谱)检测和HPLC检测方法，可应用于临床利血平中毒检验诊断和利血平中毒死亡的法医学检验。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　利血平对照品(中国药品生物制品检定所，利血平片(石家庄市太行医药有限公司提供);内标：SKF525A(中国标准技术开发公司);10%盐酸溶液;乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

　　1.2 仪器与色谱条件

　　岛津LC210A Tvp高效液相色谱仪，SPD210AV vp紫外可见检测器，CTO210A vp柱温箱，C2R7A数据处理机，超声细胞粉碎(JYD–650L智能型)。

　　色谱柱：Diamonsil TM(钻石)C18(4.6 mm×200 mm，5 mL);流动相：乙腈∶水(40∶60)用10%盐酸调pH值至3.00±0.05为流动相;检测波长为268 nm;柱温：35℃;理论板数按利血平峰计算应不低于5 500。

　　1.3 提取与检测

　　取固体检材1 g或血1 mL，加蒸馏水1 mL，加入内标液20 μL，振荡，固性检材超声细胞粉碎(JYD650L智能型)匀浆3 min，10%盐酸调pH 2～3，振荡摇匀，加入5 mL二氯甲烷，振荡15 min，1 800 r/min离心10 min，将上清液移入另一干净且干燥试管中，重复萃取1次。60℃恒温水浴中挥干，20 μL流动相定容，注入液相色谱仪，记录色谱图，保留时间定性，内标法和工作曲线法定量。

　　1.4 动物实验

　　Wister大鼠6只，(200±10) g，河北省实验动物中心提供，实验前禁食24 h。经灌胃匀速注入利血平2 mg/kg(相当于临床最大剂量的125～250倍)，3 h立即处死，取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑按上述方法条件提取检测其中利血平含量。

　　2 结 果

　　2.1 HPLC/MS图，HPLC图(见图1～3)

　　图1 染毒大鼠肝脏中利血平的高效液相色谱图

　　图2 利血平标准质谱图图3 SKF525A标准质谱图

　　2.2 响应曲线和精密度

　　取利血平标准液(1 mg/mL)，用流动相将母液稀释成40.0，30.0，20.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0 μg/mL的标准溶液系列。之后分别取20 μL标准溶液，依上述液相色谱条件下进样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归，得其回归方程式为Y=85.75X-15.187(r=0.987 9)，两者之间线性关系良好，经t检验有统计学意义(P<0.05)，检出限为20 ng(S/N>3)。

　　取浓度为0.5，1.0，0.0 μg/μL的3种标准溶液在上述气相色谱条件下每样品每日测定5次，连续测定3 d，其日内、日间保留时间为(13.5±0.013) min，(13.5±0.27) min。

　　2.3 标准曲线和提取回收率

　　分别取空白肝组织1 g和心血1 mL，各12份，置于离心管中，加内标液20 μL(1 mg/mL)，振荡，按加入利血平标准液配制成质量浓度为0.1，0.5，10，20，40，80，120，160，180，240，280，320 μg/g的标准系列，按1.3提取和检测。建立心血和肝组织中利血平的检测标准曲线回归方程Y=56.576X+0.316 8(μg/mL)和Y=38.567X+0.0540(μg/g)，式中Y为心血或肝组织中利血平浓度，X为利血平峰面积与内标峰面积比值;相关系数分别为0.995和0.984;线性范围均为(0.5～48) μg/mL，最低检出浓度为0.5 μg/g(S/N>3)。

　　取肝组织1 g或心血1 mL，各9份，分别加入标准品4 μg(3份)，8 μg(3份)，20 μg(3份)，按上述方法提取检测，标准曲线计算回收率。回收率分别为：(96.50±3.0)%，(97.5±2.5)%。

　　2.4 染毒大鼠体内利血平检测

　　染毒大鼠心血和各脏器中均检出利血平。大鼠心血、心、肝、脾、肺、肾、脑的含量依次为：(316.39±6.43)，(284.96±3.03)，(353.82±7.73)，(185.74±4.07)，(221.64±1.38)，(215.94±2.87)，(170.15±7.05) μg/g。

　　3 讨 论

　　在利血平已报道的检测方法中[8]，主要应用HPLC进行利血平成分的确定及药片含量的测定。本文建立生物检材中利血平的HPLC、HPLC/MS法分析方法，一方面确保定性准确，另一方面又保证了定量结果的准确[9]。以SKF525A为内标，其保留时间(Rt=18.5，利血平Rt=13.5)合适，峰型良好，与利血平分离度Rs>2，且与生物检材中的杂质峰分离良好，各组分在上述HPLC条件下保留时间适中，峰形对称，分离效果好，在较大浓度范围内有较好的线性关系，提取回收率及精密度均达到检测要求，且重现性好，灵敏度高，可满足定性、定量检验的分析要求，可用于生物检材中利血平含量的定性和定量分析[10]。

　　本实验利血平染毒大鼠体内检材用上述方法检验，同样可获得稳定可靠的分析结果。结果显示，各脏器内利血平含量变化不大，以心血、心、肝含量较高，与张新威[11]报道苯巴比妥在小剂量染毒大鼠体内分布特点结果相同。

　　生物检材中HPLC/MS检测方法选择性好，定性准确，高效液相色谱检测简便、快速、灵敏、定量结果准确，既可用于利血平中毒或死亡案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究，也可用于利血平中毒的临床快速检验诊断。

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