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【摘要】 目的用高效液相色谱法建立三七的指纹图谱。方法采用反相C18柱，乙腈水梯度洗脱；检测波长203 nm；流速1.0 ml/min进行试验。根据相对保留值α和相对面积Sr对色谱指纹图谱进行分析对比研究，建立了一个快速、简易鉴别三七样品的色谱指纹图谱分析方法。用指标成分三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re进行了定位，并测定了它们的含量。结果建立了HPLC指纹图谱共有模式，并根据相对保留值α和相对面积Sr进行了比较。结论 该法为中药样品的鉴定提供了较全面的信息，三七样品指纹图谱及指标成分含量测定可用于全面控制三七药材的质量。
【关键词】 三七； 高效液相色谱； 色谱指纹图谱
Studies on Fingerprint of Panax notoginseng (Burk.)F.H. Chen by High Performance Liquid Chromatography
XIE Guoxiang, QIU Mingfeng, JIA Wei
（School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）
Abstract：ObjectiveThe chromatographic fingerprint of Panax notoginseng (Burk.)F.H. Chen was established by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsThe HPLC fingerprints was established with an RP-C18 column, acetonitrile-water gradient elution, a DAD diode array detector at 203 nm and the flow rate of 1.0ml/min, column temperature of 35℃。According to the relative retention value α and the relative area Sr resultants in chromatographic fingerprint, their comparative study was achieved. It established a chromatographic fingerprint method for fast and simple identification of Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen. Fingerprints were positioned with index composition such as notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1, Rb1, Re and then the saponins were determined.ResultsThe mutual mode of HPLC fingerprints was set up and the relative retention value α and the relative area Sr were compared．ConclusionThis method provides useful information for identification of traditional Chinese medicines and the fingerprints of samples of Panax notoginseng (Burk.)F.H. Chen can be used to control the quality of combined with content determination.
Key words：Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen; HPLC; Chromatographic fingerprint
中药在许多国家越来越受到人们的重视，但是它们的质量控制方法仍然是普遍存在的一个问题。由于中药所含化学成分的复杂性，在目前的技术条件下，要想测定中药所含的化学成分是非常困难的。不同种中药之间的区别、同种中药（产地、采收期不同）的差异，归根结底在于其化学成分的种类和含量存在差异，这种差异可以通过现代分析手段—中药指纹图谱特征反应出来。
色谱指纹图谱用于中药的表征和质量控制已越来越引起广泛的关注［1～4］。色谱指纹图谱是在固定实验条件和实验方法下，得到同一样品不同批次的色谱图谱。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为这类混合物质群的质量控制方法［5］。同样欧洲也将色谱指纹图谱作为植物药制剂的评价方法［6］。
三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.)F.H. Chen的干燥根，性味甘、微苦、温。主要用于治疗咯血、衄血、外伤出血、跌打肿痛。药理资料证明［7，8］，三七具有抗血栓、改善心血管功能和很强的止血作用。中国中医研究院中药研究所与云南文山州科委合作进行的开发应用三七的基础研究结果表明：在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力方面，在相同剂量下，三七皂苷的作用大于人参皂苷。三七中的主要成分为总皂苷，总皂苷中有多种皂苷，有人参皂苷Rg1，Rb1，Re，Rd，三七皂苷R1等，为提高药材质量，促进优质药材规范化生产基地的建立，我们对三七总皂苷类成分进行指纹图谱研究，实验证明该方法操作性强，重现性好，可作为三七的指纹图谱。
本实验采用高效液相色谱方法研究了云南不同产地10个三七样品的指纹图谱，并利用相对保留值这一参数，来研究三七药材之间的差异；用指标成分三七皂苷R1(notoginsenoside R1)，人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)，人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)，人参皂苷Re(ginsenoside Re)进行了定位，并测定了它们的含量，为三七的质量控制提供了依据。
1 器材
Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DAD二极管阵列检测器；Agilent Chemstation色谱工作站。乙腈为色谱纯（Merck公司）；超纯水（实验室自制）；三七采自云南。三七皂苷R1（批号110745-200312，中国药品生物制品检定所），人参皂苷Rg1（批号110703200322，中国药品生物制品检定所），人参皂苷Rb1（批号110704-200319，中国药品生物制品检定所），人参皂苷Re（批号110754200320，中国药品生物制品检定所）。
2 方法
2.1 色谱条件大连Elite C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，i.d.）；乙腈-水为梯度流动相（见表1）；温度35℃；检测波长203 nm；流速1.0 ml/min；进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备分别精密称取三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re对照品，用甲醇溶解定容。制成浓度为三七皂苷R1 18.9 mg/ml，人参皂苷Rg1 10.5 mg/ml，人参皂苷Rb1 10.5 mg/ml，人参皂苷Re 5.6 mg/ml的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备称取三七药材10 g(三七药材的产地见表2)，用75%乙醇100℃提取3次（各300，300，300 ml），每次120 min，过滤，浓缩，残渣用甲醇超声溶解，定容于100 ml容量瓶中。用0.45 μm有机膜滤过，进样量10 μl ，流动相见表1。
3 结果
3.1 参照物色谱峰的鉴定在203 nm波长下，用表1的流动相测定参照物三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re，其保留时间分别为23.54，32.056，35.338和53.875 min，并与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较，确定三七样品指纹图谱中相应的峰，见图1～2。
表1 测定三七样品的流动相（略）
表2 药材样品（略）
图1 三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1和人参皂苷Re的HPLC色谱图（略）
3.2 色谱指纹图谱的建立三七样品在上述实验条件下，其色谱峰分离度，峰形均较好，见图2。在色谱图上选择一个特定色谱峰，该峰为所有样品所共有，且位于色谱图较中心位置和具有较高的强度，将其指定为参考峰。在此基础上求出所有色谱峰的相对保留值。
相对保留值计算公式为：α=tri/trs。其中tri为待测峰的绝对保留时间，trs为参考峰的绝对保留时间。
相对面积计算公式为：Sr=（待测峰i的相对面积/标准样品的总面积）×100
其中，三七3号样品的液相色谱指纹图谱如图3所示。
基于3号样品色谱峰总面积较大，峰数较多且具有代表性，将其指定为标准，以求出待测峰i的相对面积。将样品中各组分的相对保留值α按大小排列，并在每个α值项下标出该组分的相对面积Sr，再将不同样品中具有相同α值Sr做比较分析如表3所示。表中无对应的相对面积Sr时表示该样品不具有该α值的色谱峰。
图2 不同产地三七样品的指纹图谱（略）
图3 3号样品的高效液相色谱指纹图谱（略）
3.3 三七样品的色谱指纹图谱特征各样品的色谱指纹图谱很相似，α值为0.229有一较强峰，0.732和1.725处均有一独立的强峰为主要特征。
色谱指纹图谱八强峰是指某样品的色谱峰中相对面积值Sr较高的前8个色谱峰。表4是三七10个样品的色谱指纹图谱八强峰。色谱指纹图谱重叠率计算公式为：重叠率(%)=［2×(待测样品与标准样品共有峰)/(待测样品峰数+标准样品峰数）］×100%。
3号样品的指纹图谱亦被指定作为标准，以此求出其余9个样品的色谱指纹图谱重叠率。10个样品的色谱指纹图谱重叠率从1号到10号分别为：73.68，81.08，100(3号样品为标准)，88.89，77.78，81.08，74.29，71.79，81.08和87。
表3 10个样品色谱指纹图谱分析（略）
表4 10个样品的色谱指纹图谱八强峰（略）
3.4 三七中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re的含量测定
色谱条件为：大连Elite C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm，i.d.）。乙腈-水为梯度流动相（见表1）；温度35℃；检测波长203 nm；流速1.0 ml/min；进样量10 μl。
三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re回归方程和相关系数见表5；三七中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re的含量测定结果见表6。
表5 三七中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re的回归方程、相关系数及线性范围（略）
表6 三七中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re的含量（略）
4 讨论
研究的三七指纹图谱具有比较好的稳定性和重复性。通过测定，10个三七样品指纹图谱的特征性及专属性很强。
在用色谱指纹图谱研究的样品中，具有相同相对保留值α的峰，即为色谱指纹图谱共有峰。从表中三七样品的色谱指纹图谱分析可以看出，相对保留值α：0.732，1.111，1.725，1.778，2.260为三七样品的八强峰且都为100%共有峰。这5个色谱峰为三七的基本组成成分，可作为鉴别三七的必要条件之一。十几个共有峰稳定性很好，且特征的三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re的峰很明显，三七皂苷R1的含量为0.75～0.95 mg/ml，人参皂苷Rg1的含量为2.5～3. 5 mg/ml，人参皂苷Rb1 的含量为2.5～3.0 mg/ml，人参皂苷Re的含量为 0.50～0.70 mg/ml。
中药提取物在给定实验条件下所得到的色谱指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况，其特征峰可作为鉴别中药的依据。将三七的指纹图谱与三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1和人参皂苷Re的含量测定结合起来可全面控制三七药材的质量。
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