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【摘要】 目的 运用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）技术对一起C群流脑爆发疫情所分离的菌株进行同源性分析。 方法 对分离的脑膜炎奈瑟菌进行血清学鉴定后，并进行ＰＦＧＥ分析和确定分子分型。 结果 在疫情中分离的6株C群脑膜炎奈瑟菌菌株的 ＰＦＧＥ 谱型相同，聚类图谱分析相似性为100%，而与韶关翁源1株从健康人分离到的菌株谱型完全不同。 结论 ＰＦＧＥ 可以作为爆发流行中对细菌进行鉴定和确定菌株的感染来源。
【关键词】 脑膜炎奈瑟菌 脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ） 鉴定
Study on the typing of strains isolated from an outbreak of epidemic cerebrospinal meningitis through pulsed-field gel electrophoressi.
LIU Mei-zhen, KE Bi-xia, DENG Xiao-ling, et al.
(Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 510300, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To analyze the strains isolated from an outbreak of epidmeic cerebrospinal meningitis occurred in Dongguan City of Guangdong Province due to Neisseria meningococcus of C Group ( Nm C). Methods The seven strains of C group of Nesseria meningitis isolated were molecularly typed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) after serological differentiation. Results The mapping of six out of the seven strains were belonged to the same pattern by PFGE with similarity of 100% and the mapping of another strains isolated from Wengyuan of Shaoguan City was totally different. Conclusion This outbreak of epidemic cerebrospinal meningitis is caused by Nm C and PFGE can be used for identification of pathogenic bacteria in an outbreak of a disease.
Key words：Neisseria meningococcus; Pulsed-field gel electrophoresis; Differentiation
流行性脑脊髓膜炎（以下简称流脑）是冬春季的常见病、多发病，此病在我国属于重点防治的乙类急性传染病。我国过去曾发生过几次大规模的流行。自1985年开始，全国实施了A群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖菌苗接种，流脑的发病率明显下降。多年来，全国流脑流行菌群主要是A群脑膜炎奈瑟氏菌，由C群引起的流脑暴发疫情较为少见。2004年3月广东省东莞市发生了一起流脑局部暴发，这是广东省近年来经病原学证实的首起C群脑膜炎奈瑟氏菌引起的暴发疫情［1］。我们对该起疫情进行了深入调查，从病人及其接触者中共分离到6株C群脑膜炎奈瑟氏菌。本文使用 PFGE 技术对菌株进行 PFGE分析，并进行菌株分子分型。
1 材料与方法
1.1 标本来源与分离鉴定 6株C群Nm 来自2004年3月广东省东莞市暴发流脑的病人菌株及病例接触者菌株。本次疫情共发病3例，其中男性患者2例，女性患者1例。从女性患者（病例3 18岁，安徽省宿州县芦苓镇人）脑脊液中分离到菌株，经鉴定为革兰氏阴性双球菌，其菌落形态、生化反应均符合脑膜炎奈瑟氏菌特征，采用中国预防医学科学院传染病所生产的诊断血清进行玻片凝集，鉴定为C群脑膜炎奈瑟氏菌。另从暴发点病人(病例1和2)密切接触者及同厂工作环境相同人员的咽拭子标本中分离到C群Nm 5株。1株C群Nm为2005年韶关翁源健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌调查所分离到的菌株。
1.2 主要试剂和耗材 限制性内切酶Nhe I购自大连宝生物（TaKaRa）公司、Xba Ⅰ酶购自美国Promega 公司；蛋白酶K为MERCK公司产品：脉冲场电泳用琼脂糖为为美国Cambrex公司生产的SeaKem Gold Agarose。均在有效期内使用。一次性5ml试管为BD公司Falcon 2054。
1.3 主要仪器 PFGE仪为 BIO-RAD CHEF MAPPER 电泳仪, 凝胶成像分析系统为Gel Doc EQ(Bio-rad)。测定细菌浓度使用美国DADE BEHRING公司产品的细菌浊度仪(Micro Scan Turbidity meter)。其他主要仪器包括恒温水浴箱离心机。
1.4 实验方法 参考Bygraves,Maiden［2］的方法进行PFGE分型。使用内切酶为 NheⅠ。电泳条件：初始脉冲时间1S；最终脉冲时间25S；电压6V/cm；电泳时间16h；温度14℃。具体步骤如下。
1.4.1 胶块制备 挑取单菌落，在普通血平板上密集画线，37℃ 5% CO2培养18～24h，用接种环从分离培养的培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于 盛有2ml细胞悬液（CSB）的5ml一次性试管中，用浊度仪测定其浊度，并调整至 5.4～5.6Mc Farland。取 400μl 细菌悬浊液于相应的 1.5ml eppendorf 管中，置于37℃水浴中孵育 5min。每管加入20μl 蛋白酶k 混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。制备好1% Seakem Gold：1%SDS，置于 56℃水浴箱中。在eppendorf管中加入 400μl 的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀，加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10～15min。
1.4.2 细胞裂解 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml 细胞裂解液加入 25μl 蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，混匀。每个管子加入5ml 蛋白酶 K/CLB 混合液。确证胶块在液面下。管子在 54℃水浴摇床中孵育2h，转速约170转/min，纯水和TE放在 50℃水浴摇床中预热。
1.4.3 胶块洗涤 每管中加入15ml 预热的纯水。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放50℃水浴摇床中，10min，重复一次。倒掉水，加入 15ml预热的TE，在 50℃的水浴摇床中摇15min，重复3次，倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
1.4.4 胶块内DNA 酶切 按照每200μl总体积缓冲液M含180μl纯水和Buffer M 20μl，混匀。在每个1.5ml eppendorf 管中加入200μｌ缓冲液M 的稀释液。切下2mm 宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中，确保胶块在液面下面，放在37℃水浴中孵育10～15min。在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照每200μl总体积酶切缓冲液中含纯水78μl、Buffer M 20μl和酶（10U/μl）2.14μl，混匀。每管加入 200μl混合液，确保胶块在液面的下面，在37℃水浴中孵育至少2h。用同样的方法处理标准株H9812的胶块(用缓冲液H，XbaI酶切)。
1.4.5 加样 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。用枪头吸出酶切混合液，每管加入200μl 0.5×TBE。把胶块加在梳子齿上，用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3min。把梳子放入胶槽，确保所有胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽下部中央缓慢倒入100ml 熔化的55～60℃ 平衡的1%SKG。在室温下凝固 30min 左右。
1.4.6 电泳 加入 2.2L 0.5×TBE，关上盖子。 设置电泳参数。电泳时间为16h。记录电泳初始电流。电泳结束后，0.1μg/ml的EB染色30min，于纯水中脱色30min，换水3次，用Gel Doc EQ拍摄图像。转换成*.tif文件用于处理分析。用Bionumerisc V4.0软件对数据进行聚类分析，方法采用UPGMA,聚类相似系数(距离)采用的是基于条带比较的Dice。
2 结果
2.1 血清学鉴定 从东莞病人及病人密切接触者中分离的6 株菌及2005年韶关翁源健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌调查分离的1株菌株，经血清学及生化鉴定均为C群脑膜炎奈瑟菌。
2.2 PFGE图像分析 从图1看出，东莞C群病人（病例3）菌株与前两例病例的密切接触者中分离的5株C群Nm菌株的PFGE谱型完全相同。与2005年韶关翁源健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌调查所分离到的C群Nm菌株PFGE谱型明显不同（图1）。图像文件使用 Bio Numerics(Version4.0)数据库软件进行处理，识别图像条带。聚类图谱分析相似性在100%。从PFGE结果我们可以追溯出，2004年东莞市C群流脑暴发疫情确实是由同一克隆菌株引起的。
3 讨论
脉冲场凝胶电泳是目前国内外流行病学研究广泛接受的方法之一， 与其他方法相比，具有重复性好、分辨率高 、结果稳定、易于标准化的优点， 能在细菌基因组很庞大的情况下，尽可能反映较多的变异信息。它可以用于大分子DNA 的分离，其分辨范围达到10Mb。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测［3,4］、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义［5,6］。目前以美国CDC发起，全球20多个国家参与的PULSENET 就是由 PFGE 技术为核心，在世界范围的疾病监测中发挥巨大的作用。美国Swaminathan等人已经发展了针对大肠杆菌O157：H7、沙门菌属的 typhimurium 血清型、李斯特菌、志贺菌属等的标准PFGE 操作方法［3］，并建立了大肠杆菌O157：H7的全国监测网络PULSENET和 PFGE 指纹图谱数据库。中国也加入了这个网络，并开始建立各病原菌PFGE 分析标准化操作规程，建立标准图谱数据库。
图1 广东7株C群脑膜炎奈瑟菌 PFGE 分型电泳图（略）
注：M为Salmonella(H9812)参考标准株DNA经过Xba I酶切之后电泳，1为从病人分离到的C群Nm菌株，6为2005年韶关翁源健康人群流脑监测分离到的C群Nm菌株。2～5和7等5株均为从病人（首两个病例）的密切接触者分离到的C群Nm菌株。
本次疫情在20d内发生3例流脑病例，看似散发疫情，但3例均为同一工厂员工。第1例及第2例均没有分离到菌株，第3例病人与前两例也没有明确的接触史。为了分析菌株之间的相关性，将从第3例病人分离到的C群Nm菌株与第1例、第2例的密切接触者分离到的C群Nm菌株进行PFGE 分析，图谱结果完全一致，可以证实该起疫情来自同一菌株。
近年来广东省流脑有一明显的特点是民工流脑的发病率较高，而且往往是聚集性发病。因此，今后对流脑预防控制措施作相应调整，一旦发生流脑疫情尤其是外来人群聚集的地区，除了采取通风等综合性措施外，应及时对重点人群应急接种A+C流脑多糖疫苗，对密切接触者选择敏感的药物进行预防性服药，防止发生聚集性病例疫情。
【参考文献】
［1］ 刘美真，杜志明，张莉萍，等. 广东省2004年流脑监测结果分析［J］. 华南预防医学，2005，4（31）：18～20.
［2］ Bygraves JA,Maiden MC. Analysis of the clonal relationships between strains of N.meningitides by pulsed-field gel electrophoresis［J］. J Gen Microbiol,1992,138:523～531.
［3］ Swaminathan B,Barrett TJ,Hunter SB,et al.PulseNet:the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance,United States［J］. Emerg Infect Dis,2001,7:382～389.
［4］ Bender,JB,Hedberg CW,Besser JM,et al.Surveillance for Escherichia coli O157:H7 infections in Minnesota by molecular subtyping［J］. N. Engl J Med,1997,337:388～394.
［5］ Centers for Disease Control and Prevention.Outbreaks of Escherichia coli O157:H7 infections among children associated with farm visits-Pennsylvania and Washington,2000［J］.Morb Mortal Wkly Rep,2001,50:293～297.
［6］ Gouveia S,Protor ME,Lee MS,et al.Genomic comparisons and Shiga toxin production among Escherichia coli O157:H7 isolates from a day care center outbreak and sporadic cases in southeastern Wisconsin［J］. J Clin Microbiol,1998,36:727～733.
作者单位：广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300； 东莞市疾病预防控制中心,广东 东莞 511700.