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【摘要】 目的 探讨分化抑制因子nm23-H1蛋白在慢性粒细胞白血病(CML)患者中的表达和临床意义。 方法 采用酶联免疫法检测72例慢性粒细胞白血病(CML)患者和36例健康对照组血浆中nm23-H1蛋白的含量。 结果 CML慢性期(CML-CP) 血浆nm23-H1 蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；加速期(CML-AP)和急变期(CML-BP)明显高于对照组(P<0.01) ，CML-BP明显高于CML-AP组(P<0.01)。 结论 提示在CML中，血浆nm23-H1蛋白表达水平的检测可能有助于CML的病情进展、临床分期及预后判断。
【关键词】 慢性粒细胞白血病 分化抑制因子 nm23-H1
nm23是一个多功能基因，除了具有肿瘤转移抑制作用，对细胞的增殖、分化、个体发育也具有调控功能。研究发现，nm23基因能抑制白血病细胞的分化，与白血病的恶性增生、预后及复发密切相关。其中nm23-H1基因表达与肿瘤的转移和预后关系更密切。为此我们检测慢性粒细胞白血病患者血浆中nm23-H1 蛋白的表达水平，探讨其在慢性粒细胞白血病中的表达和临床意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象 慢性粒细胞白血病(CML)患者72例为我院2004年1 月～2007 年12月，血液内科收治的病例，经临床及实验室确诊，符合FAB分型标准［1］。其中慢性期（CML-CP）37例，加速期（CML-AP）15例，急变期（CML-BP）20例，其中8例为急淋变，其余为急粒变；男40例，女32例；年龄23～68岁，中位年龄52岁。36例健康对照组，男19例，女17例；中位年龄44岁。
1.2 检测方法
1.2.1 标本 所有受检者均用无菌抗凝(肝素)管采集静脉血，置于冰上至少10min，4℃下，2 000r/min，离心5min，用0. 22μm超微滤纸滤过，提取血浆， 分置两个EP管中，储存于-80℃，待测。
1.2.2 nm23-H1蛋白测定方法 采用EL ISA 方法，nm23H1蛋白测定试剂盒购自深圳依诺金生物科技有限公司。两组均取待测血浆标本在37℃环境下温育30min，并以96孔板进行标记。取nm23-H1蛋白标准品1支，加入500μl稀释液在1 ml小离心管内混匀为A管(含标准品250ng/ml) ，另取1ml小离心管7支(B、C、D、E、F、G、H)分别加入250μl样品液，从A管吸取250μl标准品加入B管，混匀(B：125ng/ml)依次倍比稀释至G(62.5ng/ml)、D(31.25ng/ml)、E(15.6ng/ml)、F(7.8ng/ml) 、G(3.9ng/ml)管，H管为零对照管。样品孔每孔分别加50μl稀释液及待测血浆，各标准品每孔加100μl做复孔，空白孔不加样，37℃温育60min。清洗液300μl/孔，洗板4 次。加多抗100μl/孔，37℃温育60min，洗板。加酶标抗体100μl/孔，37℃温育45min，洗板。显色液A50μl/孔，显色液B 50μl/孔(先加A 液再加B液)，37℃温育15min (从加B液算时间) 。终止液100μl/孔。测定450nm的OD 值，样品孔的OD值=所测得OD值-空白孔OD值。
1.3 统计学方法 用SPSS10.0统计软件完成。数据以均(x±s)表示，两组nm23-H1蛋白表达水平比较用方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
两组nm23-H1蛋白表达水平比较 37例CML-CP病人的血浆nm23-H1蛋白表达水平为6.95±2.8与对照组的5.9±1.1比较，差异无统计学意义（P>0.05），而CML-AP和CML-BP组患者血浆nm23-H1蛋白表达水平分别为40.7±3.9和59.4±4.1均明显高对照组，差异有统计学意义（P<0.01），并且也明显高于CML-CP组（P<0.01）；CML-BP组血浆nm23-H1蛋白表达水平明显高于CML-AP组（P<0.01）。
3 讨论
nn23基因是近几年来令人关注的基因之一,它的表达水平与某些肿瘤的转移和预后相关，被认为是一种肿瘤转移抑制基因。Chen等［2］检测54例非小细胞肺癌组织和46例正常肺部组织中nm23-H1 mRNA的表达量，并通过PCR-SSCP对组织中nm23-H1基因结构进行分析，发现nm23-H1 mRNA的减少抑制了细胞的分化，加速了淋巴结转移。Branca等［3］用免疫组化法检测150例鳞状上皮细胞癌( SCC)和152例宫颈上皮内瘤样病变(CIN) 中的nm23-H1表达，结果表明在单变量分析中nm23-H1的低表达与宫颈癌低存活率密切相关(P=0.022)，提示nm23-H1的低表达是宫颈癌预后差的一个显著指标。
而在造血系统，nm23基因与细胞的增殖和分化活动有关，对于白血病患者，nm23基因的表达可能是预后不良的因素。Magyarosy 等［4］发现在急性淋巴细胞白血病中，nm23在低分化的细胞中表达量高于相对分化好的细胞。朱宁希等［5］研究1，25-二羟基维生素D3［1，25(OH)2D3］对白血病细胞株HL-60的诱导分化，发现1，25(OH)2D3能使HL-60细胞被阻滞在G1期，增殖减慢，形态和功能都趋向成熟分化，同时nm23-H1基因的表达明显下降。吴少玲［6］、孟庆祥［7］等采用RT-PCR)半定量分析急性白血病患者中nm232-H1的mRNA表达水平，表明nm23-H1基因可能是AML 预后较差的一种标志。提示nm232-H1的表达与白血病分化、预后相关。吴少玲等［8］用RT-PCR技术检测CML患者nm23-H1 mRNA的表达，发现CML-CR nm23-H1 mRNA表达与正常对照差异无显著性，而CML-AP、BP组nm23-H1 mRNA 表达明显增高。本实验采用酶联免疫法检测72例CML患者和36例健康对照组血浆中nm23-H1蛋白的含量，结果表明CML-CP患者血浆nm23-H1蛋白水平与对照组比较，差异无统计学意义；而CML-AP与CML-BP患者血浆水平明显高于对照组(P<0.01) 。提示nm23-H1蛋白在CML-AP、CML-BP表达明显升高。结果还显示，nm23-H1蛋白在CML-AP、CML-BP患者血浆中的水平明显高于CML-CP，而且CML-BP患者血浆nm23-H1中的水平明显高于CML-AP，结果与张瑞英等［9］报道的一致。表明血浆中nm23-H1蛋白水平与病情进展有关。综上所述，在CML患者血浆中，nm23-H1蛋白的表达水平明显高于对照组，且与疾病分期密切相关，表明检测血浆中nm23-H1蛋白表达水平可为CML临床分期及预后判断提供更多的实验室依据。慢粒急变病人常对普通化疗不敏感，病情易恶化，是否与此期血浆中nm23-H1蛋白水平明显增高有关，有待进一步探讨。
【参考文献】
［1］ 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.第2版.北京：科学出版社，1997,219～227.
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［3］ Branca M， Giorgi C， Ciotti M， et al. Down-regulated nucleoside diphosphate kinase nm23-H1 expression is unrelated to hige-risk human papillomavirus but associared with progression of cercical intraepithelial neoplasia and unfavourable prognosis in cervicalcancer［J］. J Clin Pathol，2006，59(10)：1044～1051.
［4］ Magyarosy E，Sebestyen A,Timar J．Expresion of metastasis assaciated proteins，CD44v6 and nm23-H1，in pediatric acute lymphoblastic leukemia［J］.Anticancer Res，2001，21（1B）：819～823.
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［6］ 吴少玲，赵春亭.急性白血病骨髓细胞nm23-H1基因表达的研究［J］.中华内科杂志，2002，41（6）：367～369.
［7］ 孟庆祥，姜容，杨保青.分化抑制因子nm23 基因在急性白血病细胞中的表达及临床意义［J］.中华血液学杂志，2003，24（7）：369～371.
［8］ 吴少玲，赵新东，赵洪国，等.nm23-H1基因在慢性粒细胞白血病中表达的研究［J］.白血病.淋巴瘤，2004，13（3）：142～144.
［9］ 张瑞英，魏红，乔泽涛，等.nm23-H1在慢性粒细胞白血病患者血浆中的表达及临床意义［J］.山东医药，2007，47（35）：51～52.
作者单位：广东医学院附属湛江中心人民医院，广东 湛江 524037； 广东医学院检验医学研究所，广东 湛江 524023