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［摘要］ 目的 检测肺腺癌组织中nm23表达和p53基因外显子突变情况，寻找有助于准确预测局部肿瘤进展、分型、预后情况的临床参照指标。方法 应用PCR技术检测31例肺腺癌术后存档蜡块组织中nm23表达及p53基因外显子突变情况，并与肺腺癌的病理及临床指标进行相关性研究。结果 nm23表达及p53基因突变率分别为38.7%及48.86%。nm23和（或）p53基因突变与临床分期呈正相关（P＜0.01）。结论 nm23表达和（或）p53基因突变与肺癌临床分期和生存相关。nm23基因表达及p53基因突变在判断肺腺癌细胞增殖、分化程度、恶性进度及预后转归方面有一定价值，可作为判断腺癌预后的参考指标，指导高危患者的进一步治疗。
［关键词］ nm23;p53;肺癌
Expression of mutation and significance of tumor metastasis suppressor gene nm23 and p53 in lung cancer
MAO Wei-min，CHEN Xu-feng，SHU Yue，et al.Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China
［Abstract］ Objective Our study was aimed to investigate whether nm23 expression and p53 gene mutation in the primary cardiocarcinoma correlated with tumor staging，recurrence，metastasis and patient survival time.Methods RT-PCR and PCR-SSCP were used to test the expression of nm23，test the mutation in p53 of the samples.31 cases paraffin embeded samples were selected.Results The gene expression rate of nm23 were 38.7% and the gene mutation rate of p53 was 48.86%.All expression and mutation happened in the low grade tumor.In this study，nm23 gene expression and p53 gene mutation were correlated with histological grade and clinical stage closely.Conclusion We found that nm23 and p53 are play important role in the development and progression of lung cancer.Nm23 and p53 appear to be associated with the proliferation and progression of lung cancer.Both of them can be used as prognostic factors in lung cancer.
［Key words］ nm23;p53;lung cancer
目前认为肿瘤的发生是细胞内单基因或多基因发生改变决定的，抑癌基因的失活和癌基因的激活是正常细胞转化为癌细胞的主要原因［1，2］。nm23基因、p53基因是目前发现分布最广，与肿瘤相关性最高的癌相关基因，它们与肺癌的相关性报道虽较多，但结论不一，且多为单一因素分析。为寻找有助于准确地预测局部肿瘤的进展、分型及预后情况的临床参照指标，笔者采用PCR-SSCP（polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism）和RT-PCR技术检测了31例肺癌术后石蜡包埋病理切片中的nm23表达及p53基因外显子突变情况，并分析其与肺癌发展及预后的关系，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 标本选用浙江省肿瘤医院胸外科和浙江医院胸外科1993～2000年肺癌切除、病理蜡块31例，男12例，女19例，年龄35～80岁，平均63岁。病理：中分化腺癌5例，低分化腺癌24例，乳头状腺癌1例，腺泡细胞癌1例。Ⅰa 1例，Ⅰb 2例，Ⅱa 6例，Ⅱb 4例，Ⅲa 18例。按国际联合抗癌联盟UICC标准：Tis～T1 9例，T2～T3 14例，T4 8例，另取2例正常肺癌组织蜡块作为对照。随访1～9年。
1.2 方法
1.2.1 提取DNA 取石蜡包埋病理标本，切片5 μm厚，取3～4片标本剪碎置于1.5 ml EP管中，加入二甲苯脱蜡，离心弃上清液，沉淀后依次加入100%、95%、70%乙醇漂洗。加入消化液和蛋白酶K混匀，50 ℃过夜；用蛋白沉淀液沉淀蛋白质，离心，将上清液转入新的EP管中，加入冷乙醇沉淀DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 PCR扩增 用已定量的DNA样本进行PCR扩增。所有试剂均采用nm23（RT-PCR用β-actin作为内对照）及p53突变检测试剂盒。PCR反应总体积为25 μl。PCR扩增程序：p53：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，用SSCP检测常规灌制8%聚丙烯酰胺凝胶，取p53扩增产物加入变性上样缓冲液，95 ℃变性10 min，点样，120 V电泳3 h，硝酸银染色，nm23：PCR扩增程序同前，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。分析结果。
1.2.3 统计学方法 应用SPSS 11.0软件统计，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 PCR扩增产物鉴定 以β-actin为DNA分子量标准参照，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，31例肺癌标本nm23阳性为12例提示其nm23基因表达。2.2 p53用SSCP分析 在31例肺腺癌病理标本中，在p53基因中第7、第8外显子分别存在泳动变位的例数是10例、5例，共10例提示其p53基因存在突变。nm23阳性率及p53基因突变率分别为38.7%及48.4%（见图1、2）。图1显示nm23表达情况，N为正常带，T为肿瘤标本。图2中，3、4、5带显示DNA泳动变位，提示这3例标本p53第8外显子有碱基改变。
2.3 随访 31例均做随访，除1例失访按死亡计算外，随访率96.8%。Ⅰa期1例术后未做特殊治疗，余30例做术后方案为CAP、MVP、NP、GP 4周期的化疗。除1例术后8个月死于脑转移外，余30例均生存1年以上（见表1）。nm23表达阳性与p53突变与分期、病理分化程度和生存情况的关系（见表2）。虽病例较少，但nm53阳性表达者3年以上生存率较高，与1年生存者相比有统计学上的差异（P＜0.01）。也以早期肺癌表达较高。而p53外显子的突变却以分期较晚，病理分化较低，3年以内（含3年）生存者为多，与5年生存者的突变率相比也具有统计学上的差异（P＜0.01）。表1 分期与生存时间关系表2 PCR检测与临床资料关系
3 讨论
肿瘤转移是肿瘤患者主要死亡原因之一，肿瘤的发生和转移是两个相互关联又各自独立的生物学过程，转移可受自身的转移基因及转移抑制基因的调控［3，4］。肿瘤转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞运动，浸润周围组织，穿透基膜，逃逸免疫反应并在远离原发部位增殖，形成转移灶。寻找在转移过程中起作用的基因，可指导对转移性肿瘤的诊断和治疗策略。为阐明肿瘤发生、发展是一个多基因、多阶段的遗传学改变过程，我们用PCR-SSCP检测了31例肺癌肿块存档石蜡标本中nm23基因表达及p53基因突变情况。发现nm23在肺癌组织中表达较高为38.7%，其阳性表达表现在早期和预后较好者，与病理类型无明显的相关，本组Ⅲa期者仅有2例表达，而阳性表达的有50%（5/10）生存超过5年。提示nm23的阳性表达与肺腺癌的期别、预后不良呈负相关。也符合该基因在肿瘤的发展和转移呈负相关的作用［5］；p53抑癌基因突变位点以第7、8外显子为主，突变率为48.86%。p53基因突变主要发生在细胞分化不良及肿瘤已发生转移的肺癌标本。本组31例标本中有p53第7外显子突变的病例有Ⅲa 5例，其中3例均于术后2年内死亡。本研究结果表明，p53突变与肺癌临床分期和预后不良呈正相关（P＜0.01）。结合以上结果可以看出，提示nm23表达和（或）p53基因突变在肿瘤形成、发展中是早期事件，对控制细胞的增殖、恶性细胞转化起作用。同时具有nm23表达和（或）p53基因突变是肺癌加速发展与否的信号，应引起临床重视，可作为判断肺癌恶性程度及进展情况的有价值的参考指标。所以开展nm23表达合并p53基因突变检测有助于筛选是否具有转移潜能的肺癌肿瘤，用于更准确地评估病人预后及转归，同时可指导手术后的整体治疗方案。肿瘤的发生是多基因协同作用的结果，nm23、p53基因的突变可能通过增加基因变异事件的积累而起作用，并影响着肿瘤发展。因此，只有对多种癌基因、抑癌基因及其他相关因素进行综合研究才能将我们对肿瘤发生、发展过程的认识提高到一个新阶段，本研究有助于肺癌肿瘤在分子水平上进行解释，其结果展示了癌相关基因研究的临床应用前景，并为今后发展转基因治疗提供了线索。
［参考文献］
1 Itahana K，Dimri GP，Hara E，et al.A role for p53 in maintaining and establishing the quiescence growth arrest in human cells.J Biol Chem，2002，277（20）：18206-18214.
2 Murdoch WJ，Van Kirk EA.Steroid hormonal regulation of proliferative，p53 tumor suppressor，and apoptotic responses of sheep ovarian surface epithelial cells.Mol Cell Endocrinol，2002，186（1）：61-67.
3 Devita VT.Cancer principles and practice of oncology.Philadelphia： JB Lippincott Co，1989，98.
4 Yamaguchi A，Urano T，Goi T，et al.Expreeion of nm23-H1 and nm23-H2 protein in hepatoocellular carcinoma.Cancer，1994，73：2280.
5 毛伟敏，高永良，郑树.肿瘤转移相关基因表达与预后关系.浙江肿瘤，1997，3（1）：46-48.
作者单位： 1 310013 浙江杭州，浙江医院
2 310022 浙江杭州，浙江省肿瘤医院
（编辑：田 雨）